荒钩爪弩:肾清饮对腺嘌呤致肾间质纤维化大鼠肾脏TGFβ1及TIMP1表达的影响

【摘要】  目的 探讨肾清饮抑制肾间质纤维化的可能机制。方法 采用腺嘌呤灌胃法建立大鼠肾间质纤维化动物模型，并给予肾清饮和盐酸苯那普利干预治疗，作肾脏病理学检查，并以免疫组化和RTPCR方法分别检测大鼠肾脏转化生长因子β1(TGFβ1)、金属蛋白酶组织抑制物1(TIMP1)的表达。结果 各肾清饮干预组肾组织肾间质纤维化程度轻于模型对照组，免疫组化和RTPCR检测的肾脏TGFβ1、TIMP1的表达量均少于模型对照组(P<0.05)。结论 肾清饮可通过减少肾组织TGFβ1、TIMP1的表达，抑制肾间质纤维化的进展。

【关键词】  肾清饮;肾间质纤维化;转化生长因子β1;金属蛋白酶组织抑制物1

　　ABSTRACT: Objective To study the possible mechanism of Shenqingyins inhibiting renal interstitial fibrosis. Methods Renal interstitial fibrosis in rats was induced by intragastric administration of adenine, and then the rats underwent Shenqingyin and Lotensin intervention. Finally we made the pathological examination of renal tissues, used immunohistochemistry and RTPCR to observe the expressions of transforming growth factorβ1 (TGFβ1) and tissue inhibitor of metalloproteinase1 (TIMP1) in renal tissues. Results The degree of renal interstitial fibrosis was milder in Shenqingyin group than in model control group. Immunohistochemistry and RTPCR results showed that Shenqingyin intervention group had lower expressions of TGFβ1 and TIMP1 than model control group (P<0.05). Conclusion Shenqingyin can inhibit renal interstitial fibrosis by decreasing the expressions of TGFβ1 and TIMP1 in the kidney.

　　KEY WORDS: Shenqingyin; renal interstitial fibrosis; transforming growth factorβ1 (TGFβ1); tissue inhibitor of metalloproteinase1 (TIMP1)

　　肾间质纤维化是各种原因引起的肾脏疾病持续进展并最终发展成为终末期肾病的共同途径和主要病理基础[1]。肾间质纤维化的治疗药物种类较多，但疗效并不满意。中药肾清饮的临床观察结果显示，该药能有效地保护肾功、延缓肾衰竭的进展。本研究通过建立腺嘌呤灌胃致大鼠肾间质纤维化模型，给予中药肾清饮干预治疗，观察肾清饮对肾组织转化生长因子β1 (transforming growth factorβ1, TGFβ1)及金属蛋白酶组织抑制物1(tissue inhibitor of metalloproteinase1, TIMP1)的影响，探讨肾清饮抗肾间质纤维化的部分机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物、主要试剂及药品 雄性SD大鼠56只，体重180～200g，清洁级，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。造模试剂药品：腺嘌呤(Amerisco公司);肾清饮(黄芪、当归、川芎、藏红花、大黄、芍药、地龙等中药组成)，制成水煎浓缩液，每毫升含生药2.4g，4℃冰箱保存备用;盐酸苯那普利(北京诺华制药有限公司)。ET1放免试剂盒(北京科美东雅生物技术有限公司)。RTPCR试剂：总RNA提取Trizol试剂(Invitrogen公司)，逆转录试剂盒及Taq DNA聚合酶(Fermentas/MBI公司)。引物设计：①3磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)上游5′CATAGACAAGATGGTGAAGG3′，下游5′TCCACAGTCTTCTGAGTGGC3′，570bp;②COLⅠ上游5CCTACAGCACGCTTGTGGAT3，下游5′ATTGGGATGGAGGGAGTTTA3′，193bp;③COLⅢ上游5′TCAAGAGCGGAGAATACTGG3′，下游5′TATGTAATGTTCTGGGAGGC3′，295bp;④TGFβ1上游5′AGCCTGCTTCTTGAGTC3′，下游5′AGGAAAGGTAGGTGATA3′，241bp。引物由上海生物工程公司合成。

　　1.2 动物分组和标本采集 56只SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、肾清饮预防组、肾清饮低剂量组、肾清饮高剂量组、盐酸苯那普利组、肾清饮+盐酸苯那普利组，共7组，每组8只，其中后5组统称药物干预组。腺嘌呤：腺嘌呤用20g/L淀粉悬液配成，灌胃剂量250mg/(kg·d);肾清饮(低)：按生药折算每100g大鼠体重灌胃肾清饮1g/d;肾清饮(高)：按生药折算每100g大鼠体重灌胃肾清饮3g/d;盐酸苯那普利：盐酸苯那普利灌胃10mg/(kg·d)。造模过程中正常对照组、肾清饮低剂量组、肾清饮+盐酸苯那普利组各死亡大鼠1只，模型组死亡2只。6周结束前1d，将大鼠置于代谢笼中收集24h尿液。6周结束时乙醚麻醉大鼠，下腔静脉采静脉血，取双肾，部分置于40g/L多聚甲醛固定，部分液氮冻存。

　　1.3 病理染色及免疫组化检测 固定于40g/L多聚甲醛的肾组织，经脱水，包埋，切成4μm的切片，进行HE、Masson病理染色，并行SABC法免疫组化染色检测TGFβ1及TIMP1，操作按照说明书进行;采用德国LeicaQwin550CW图像信号采集分析系统进行图象分析，系统对图象进行灰度转化并自动测量，测量值越高表明相应蛋白表达越低，反之则越高。

　　1.4 RTPCR 取液氮中的肾组织，按照Trizol试剂说明提取总RNA，取2μg总RNA按照逆转录试剂盒要求合成cDNA，取适量cDNA作为模板分别加入GAPDH、TGFβ1、TIMP1引物，在Taq DNA聚合酶催化下进行PCR，取8μL PCR产物在15g/L琼脂糖凝胶上电泳，美国SYNGENE全自动凝胶分析仪观察并照相，同一块凝胶内参照GAPDH亮度值设为100，读取目标断片相对亮度值。

　　2.1 肾组织HE及Masson染色结果 正常对照组未见病理改变。模型对照组大鼠肾脏肥大、颜色苍白、表面凹凸不平，呈细颗粒样。镜下均出现了典型的肾小管间质损害，单位视野肾小球、肾小管比重减少，间质比重增加，伴大量炎细胞浸润;肾脏内可见棕褐色结晶沉积，周围伴有间质纤维化改变;肾小管上皮细胞肿胀，散在肾小管坏死、灶状萎缩;部分肾小管有囊状扩张或代偿肥大，可见蛋白管形和细胞管形;肾小球病变相对较轻。肾清饮干预的各组及盐酸苯那普利干预组大鼠肾脏病理改变类似于模型组的改变，但各种病变程度都明显轻于模型对照组，且以肾清饮预防组最轻。

　　2.2 肾组织中TGFβ1、TIMP1的表达 正常对照组大鼠肾脏仅有极少TGFβ1、TIMP1表达。模型对照组和各药物干预组的肾小管上皮细胞胞质、间质细胞、小球系膜细胞均可见TGFβ1、TIMP1的棕黄色颗粒，且以模型对照组阳性染色区最多最深，肾清饮预防组阳性染色区最少最浅。免疫组化半定量结果统计分析显示，TGFβ1、TIMP1各药物干预组表达显著多于正常对照组(P<0.01)，而显著少于模型对照组(P<0.01)，各药物干预组之间，肾清饮预防组表达少于其他药物干预组(P<0.01)。肾清饮低剂量组、肾高剂量组、盐酸苯那普利组和联合用药组之间TGFβ1表达没有统计学差别(P>0.05)。肾清饮低剂量组和盐酸苯那普利组TIMP1表达高于肾清饮高剂量组和联合用药组(P<0.05);肾清饮低剂量组和盐酸苯那普利组TIMP1表达没有统计学差别(P>0.05)。肾清饮高剂量组和联合用药组TIMP1表达没有统计学差别(P>0.05，表1)。表1 各组肾组织中TGFβ1、TIMP1的半定量分析与各治疗组对比，*P<0.01;肾清饮低剂量组和其他治疗组对比，△P<0.01。

　　2.3 肾组织TGFβ1、TIMP1mRNA的表达情况 各药物干预组TGFβ1、TIMP1mRNA表达量显著高于正常对照组(P<0.01)，而显著低于模型对照组(P<0.01)。各药物干预组之间，肾清饮预防组TGFβ1、TIMP1mRNA表达量低于其他药物干预组(P<0.05)。盐酸苯那普利组TGFβ1表达量高于联合用药组(P<0.05)。而肾清饮低剂量组、肾清饮高剂量组、盐酸苯那普利组、联合用药组相互之间TIMP1表达量没有统计学差别(P>0.05，表2、图1、图2)。表2 各组肾脏TGFβ1、TIMP1mRNA表达情况的比较与各治疗组对比，*P<0.01;肾清饮预防组和其他治疗组对比，

　　3 讨 论

　　腺嘌呤灌胃大鼠能形成典型均一的肾间质纤维化改变，在发病机制、病理改变及临床表现等方面与人类间质性肾炎特别是尿酸性肾病类似。因此，该模型是研究肾间质纤维化和慢性肾功能衰竭的发病机制和预防治疗的较好动物模型[2]。肾间质纤维化是以细胞外基质在肾间质的过度积聚为特征，Masson染色能反映肾间质中胶原纤维的多少。本实验Masson染色显示肾清饮干预各组和盐酸苯那普利治疗对照组肾组织胶原沉积均少于模型组，提示肾清饮具有抗肾间质纤维化作用，具有和ACEI类药物盐酸苯那普利相似的作用。

　　目前，认为肾间质纤维化是一个动态的过程，涉及到多种细胞的活化、多种细胞因子和血管活性物质、细胞外基质的生成失衡等诸多因素[3]。TGFβ1是目前最为公认的致纤维化细胞因子之一。它从多个方面促进细胞外基质(ECM)的合成，并抑制ECM的降解，导致ECM过度积聚，组织纤维化[47]。TIMP能与基质金属蛋白酶(MMP)不可逆结合，从而阻止MMP对ECM的降解，造成ECM的产生和降解失衡，间质发生纤维化[811]。本实验中无论是免疫组化还是PTPCR方法检测的肾组织TGFβ1和TIMP1的表达量，肾清饮干预的各组低于模型对照组。以上提示减少肾组织TGFβ1和TIMP1的表达是肾清饮防治肾间质纤维化的部分可能机制。而在肾清饮高剂量组、低剂量组、盐酸苯那普利、联合用药组之间的TGFβ1、TIMP1的表达，在免疫组化的蛋白水平和PTPCR的mRNA水平上未形成完全相同的结果，其原因推测可能是该两种方法都是采用了半定量方法，以及从核酸到蛋白的转录翻译过程复杂，及实验误差等因素造成。

　　肾清饮预防组大鼠肾脏病理纤维化改变明显轻于其他各药物干预组，且肾脏TGFβ1、TIMP1的表达量低于其他药物干预组，提示早期应用肾清饮，防治肾间质纤维化的疗效更佳。

　　肾清饮主要由黄芪、当归、川芎、藏红花、白术、地龙、大黄等组成，具有益气补血、活血通络的作用。现代中医药研究发现黄芪、当归、川芎、大黄等具有改善微循环、抗血小板积聚、和调节免疫等作用，抑制肾组织和其他器官纤维化的进展。总之，肾清饮可以通过减少肾组织TGFβ1、TIMP1的表达实现抗肾间质纤维化的作用。本研究为肾清饮的临床应用提供初步实验支持，并为将来进一步研究肾清饮提供初步的实验基础。

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