马克.鲁法洛浩克:黄连解毒汤对2型糖尿病大鼠靶组织葡萄糖转运子4的影响

【关键词】  2型糖尿病; 葡萄糖转运蛋白; 胰岛素; 空腹血糖

　　黄连解毒汤（Huanglian Jiedu Decoction, HLJDD）出自唐代名医王焘之《外台秘要》，是清热解毒的代表方，由黄连、黄芩、黄柏和栀子组成，传统上临床主要用于治疗相当于热毒证的感染性疾病。而最近世界权威杂志相继报道黄连解毒汤中栀子提取物京尼平［1］和黄连提取物黄连素［2］均能有效治疗糖尿病。本研究所的前期研究也证明，黄连解毒汤具有降血糖，调血脂的功效［3~5］，为了进一步深入探讨其治疗2型糖尿病的机制，本实验观察了黄连解毒汤对2型糖尿病大鼠脂肪和肌肉组织胰岛素信号转导通路中葡萄糖转运蛋白4（glucose transporter 4, GLUT4）表达及转位的影响，旨在探讨该方改善胰岛素抵抗和防治2型糖尿病的作用机制。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验动物及饲料  雄性健康Wistar大鼠，约2月龄，200～220 g，清洁级，购于湖北省实验动物研究中心。基础饲料购于同济医学院实验动物中心，高脂高热量饲料按配方（蔗糖∶猪油∶奶粉∶鸡蛋∶基础饲料＝30∶20∶4∶2∶63）配制。

　　1.2  药物及试剂  黄连解毒汤，由黄连、黄芩、黄柏和栀子按3∶2∶2∶3的比例组成，其药材购于武汉同济医院，按吴洪元等［6］报道的方法煎煮取汁，浓缩成浸膏（1 g浸膏相当于1.5 g黄连解毒汤生药），以薄层扫描方法测得其所含小檗碱为27 mg/g。临用前以含0.5％羧甲基纤维素的PBS溶液（pH 7.4）配制成含小檗碱9.375 g/L的混悬液。阿司匹林（aspirin, ASP），石家庄神威药业股份有限公司产品，临用前以含0.5％羧甲基纤维素的PBS溶液（pH 7.4）配制成含阿司匹林12 g/L［7］的混悬液；链脲佐菌素（streptozotocin, STZ），Sigma公司产品；胰岛素放免试剂盒，北方生物技术研究所产品；蛋白测定试剂盒，南京建成生物工程研究所产品；蛋白Marker，Fermentas Life Science公司产品；单克隆GLUT4抗体，R&D公司产品；βactin单克隆抗体，Lab Vision公司产品；辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG，北京中杉金桥生物技术有限公司产品；增强化学发光法（enhanced chemiluminescence, ECL）试剂盒，Pierce公司产品。

　　1.3  动物分组及处理  动物先适应性喂养2周，随机分为正常对照组和造模组，造模组经尾静脉注射STZ（30 mg/kg）后，用基础饲料喂养2周，然后作口服葡萄糖耐量试验（oral glucose tolerance test, OGTT)，筛选糖耐量异常者随机分组。HLJDD组：按剂量10 ml/kg体质量给大鼠灌服上述黄连解毒汤混悬液，每日8：30～9：30灌胃1次（以下各组灌胃药液容积及灌胃时间与此同）；ASP组：灌上述阿司匹林混悬液；模型组：灌上述含0.5％羧甲基纤维素的PBS溶液。以上3组在治疗期间喂以高脂高热量饲料；正常对照组不予任何干预。均喂养10周，末次给药后禁食12 h作OGTT，配制40％葡萄糖水按2.2 g/kg剂量灌胃，用剪尾的方法在灌胃前及灌胃后30、60和120 min从尾静脉采血，检测空腹血糖值（fasting blood glucose, FBG）及血清胰岛素（fasting serum insulin, FINS）的含量。OGTT结束后，继续喂养1周，禁食12 h后用50 mg/kg戊巴比妥腹腔注射麻醉，取一侧附睾旁脂肪和后肢骨骼肌，然后从门静脉推注胰岛素（8 U/kg），注射后4 min取另一侧附睾旁脂肪组织和后肢肌肉组织［8］，迅速冻存于液氮中，24 h后置于－80 ℃冰箱以待测GLUT4的蛋白表达量。

　　1.4  生化指标的检测  血糖用葡萄糖氧化酶法检测，空腹血清胰岛素用放免法检测，均参照说明书进行。

　　1.5  GLUT4的蛋白表达的检测  参考Klip的方法［9］提取膜蛋白。用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度后取各组样品25 μg蛋白质，以12％的SDSPAGE胶分离蛋白。然后采用湿转法（200 mA, 3 h）［10］将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上。再用含5%脱脂奶粉的TBST（含0.1％ Tween 20）室温下封闭2 h后加入一抗（1∶2 000），4 ℃过夜，洗膜后加辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶3 000），室温轻摇2 h，充分洗涤后用ECL显影曝光，洗片后用激光扫描仪测各条带光密度。

　　1.6  统计学方法  实验数据以x±s表示，采用SPSS 11.5软件处理，应用t检验进行统计学分析。

　　2  结果

　　2.1  体质量  各组在基础状态时体质量差异无统计学意义。正常对照组12只大鼠治疗前体质量为（254.58±25.76）g，治疗后为（416.75±22.75）g；模型组11只大鼠治疗前体质量为（237.92±21.77）g，治疗后为（402.76±36.40）g；ASP组20只大鼠治疗前体质量为（246.36±30.04）g，治疗后为（354.11±28.13）g；HLJDD组23只大鼠治疗前体质量为（248.71±23.85）g，治疗后为（342.80±37.59）g。但在喂养10周后， HLJDD组和ASP组体质量均低于模型组，差异均有统计学意义。

　　2.2  空腹血糖、血清胰岛素及糖耐量  ASP组FBG高于正常对照组，HLJDD组FBG无明显变化；模型组0.5 h、1 h和2 h血糖均高于正常对照组（P＜0.05）。与模型组相比，HLJDD组1 h血糖及2 h血糖均明显降低（P＜0.05），ASP组FINS明显升高（P＜0.05）。见表1。

　　2.3  脂肪及肌肉组织中GLUT4蛋白含量  各组脂肪和肌肉组织在胰岛素刺激前后的GLUT4蛋白电泳条带经光密度扫描，在胰岛素刺激前后模型组GLUT4表达水平均较正常对照组水平低。HLJDD和ASP则能明显增加其表达，差异均有统计学意义。见表2，图1、2。

　　表1  各组大鼠空腹血糖、空腹血清胰岛素及糖耐量试验结果（略）

　　Table 1  Results of FBG, FINS and OGTT in four groups

　　*P＜0.05, vs normal control group; △P＜0.05, vs untreated group; ▲P＜0.05, vs aspirintreated group.

　　表2  各组大鼠脂肪和肌肉组织GLUT4蛋白表达（略）

　　Table 2  GLUT4 protein expression of adipose tissue and skeletal muscle in four groups

　　*P＜0.05, vs untreated group; △P＜0.05, vs aspirintreated group.

　　图1  各组脂肪组织GLUT4蛋白表达（略）

　　Figure 1  GLUT4 protein expression of adipose tissue in four groups

　　图2  各组骨骼肌组织GLUT4蛋白表达（略）

　　Figure 2  GLUT4 protein expression of skeletal muscle in four groups

　　3  讨论

　　2型糖尿病的发病机制目前尚未完全弄清，但大量的证据表明，胰岛素抵抗是2型糖尿病的重要发病机制之一。胰岛素信号转导通路中任何一个因子或步骤受损都可能引起胰岛素抵抗。因此，改善胰岛素信号转导，提高胰岛素敏感性是治疗2型糖尿病的一个重要目标。在胰岛素信号转导通路中，GLUT4是多条途径的终点。它作为胰岛素作用下的主要葡萄糖运载体，在基础状态下位于细胞膜内，当胰岛素刺激或运动时，可以通过转运先前存在的GLUT4到细胞膜表面来介导外周胰岛素敏感组织（肌肉、脂肪等组织）对葡萄糖的转运和摄取［11］，因此，GLUT4表达减少、转位效率和活性降低都可导致胰岛素抵抗形成。改善以上环节可能是防治2型糖尿病的有效途径。根据中医学理论，笔者曾提出糖尿病从“毒”论治的假说，认为“热毒”，“瘀毒”，“高糖和高脂毒性”之“毒”在糖尿病的发病过程中起着重要作用［12］，在临床上尝试应用具有清热解毒作用的黄连解毒汤治疗2型糖尿病确有疗效。从胰岛素信号转导的角度，我们已经初步探讨了黄连解毒汤能上调骨骼肌组织胰岛素受体底物1表达及其酪氨酸磷酸化水平［13］。本实验在此基础上着重研究黄连解毒汤对GLUT4的影响。从本实验结果可以看出，胰岛素刺激前，各组GLUT4的蛋白表达量差异明显。各组的GLUT4蛋白表达量相比，模型组的最少，而正常对照组的最多，这提示基础状态下2型糖尿病大鼠脂肪和骨骼肌组织GLUT4的蛋白表达量明显降低。与模型组相比，黄连解毒汤和阿司匹林能提高靶组织GLUT4的蛋白表达。在胰岛素刺激后也发生了相似的改变。模型组的最少，黄连解毒汤虽然稍低于正常对照组，略高于阿司匹林组，但明显高于模型组。可见，黄连解毒汤可以促进GLUT4转位至细胞膜上，增加细胞膜GLUT4含量，提高外周组织对葡萄糖的利用率，从而改善胰岛素抵抗。黄连解毒汤是否也通过增加GLUT4的mRNA的表达及其内在活性还有待于进一步研究。应用黄连解毒汤和阿司匹林干预的大鼠胰岛素抵抗改善后，胰岛素刺激的GLUT4向细胞膜的转位明显增加，骨骼肌中胰岛素刺激的GLUT4向细胞膜转位的变化与脂肪中胰岛素诱导的改变相似。这一结果说明，2型糖尿病大鼠的外周组织中，胰岛素刺激的GLUT4向细胞膜的转位较少，进而影响外周组织细胞对葡萄糖的摄取，削弱胰岛素的降糖作用，可能是胰岛素抵抗产生的原因之一。黄连解毒汤和阿司匹林干预可部分逆转这种变化，进而增强机体的胰岛素敏感性，从而防治2型糖尿病。总之，本实验初步阐明了黄连解毒汤通过改善胰岛素信号转导而防治2型糖尿病的作用机制，为临床应用清热解毒法防治2型糖尿病提供了一定的实验依据，但其作用环节较多，要全面了解作用机制，还有待于进一步研究。

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