铁路工人先锋号愿景:血栓学检验临床应用中的几个问题及其理解

核心提示:解放军总医院 李健，副主任医师，第三军医大学医学学士，毕业后在解放军总医院先后从事临床血液学、体液学和免疫学检验，先后参编《血细胞分析技术与临床》、《贫血，血栓与遗传学检验与临床应用》和《当代血液分析技术与临床》等七部学术专著。硕士期间于军
解放军总医院
李健，副主任医师，第三军医大学医学学士，毕业后在解放军总医院先后从事临床血液学、体液学和免疫学检验，先后参编《血细胞分析技术与临床》、《贫血，血栓与遗传学检验与临床应用》和《当代血液分析技术与临床》等七部学术专著。硕士期间于军事医学科学院参与国家863项目（2002AA2Z3411）资助的药物代谢酶基因芯片的研究与制备，对芯片制备与信号检测、探针和引物的设计合成及多重扩增有深入了解。博士研究师从丛玉隆教授，方向为抗血小板治疗药物耐受的血小板活化代偿机制。近年来致力于抗栓溶栓药物的临床疗效评估与实验室监测标准化的相关研究。
伴随着人们生活水平的提高，心血管疾病发病率和病死率也成逐年增高的趋势，血栓栓塞性疾病做为多种系统疾病的并发症成为临床医学的研究重点。近年来，血栓止血学临床检验在出血性疾病的诊断、术前检查和抗凝治疗检测中得到了广泛应用。受益于检验医学的迅猛发展，自动化凝血仪的普及大大提高了检测效率，降低了系统误差，使检测结果的精密度和准确度达到前所未有的水平。然而，当前国内血栓学常规检验中仍然存在着一些误区，除了方法学本身的问题之外，缺乏对项目和检测原理的理解，也是造成目前参数使用不当、实验室难以向临床提供有力支持的主要原因。本文围绕血栓学检验标准化内容从三个方面加以讨论。
一、凝血检验的校准化与可比性
从PT和APTT检测方法建立以来，相关学者就一直致力于这两个参数的标准化，迄今为止，只有PT实现了部分标准化，也就是抗凝治疗监测中INR系统的应用；而APTT的标准化仍然停留在探索阶段。
（一）抗凝治疗监测中PT的标准化
由于凝血活酶试剂活性的差异以及报告方式的不同，抗凝治疗的患者在不同实验室得到的PT往往不具有可比性，不能用于抗凝治疗药物的调整。为此，1977年世界卫生组织将人脑来源的凝血活酶作为一级国际参考品（IRP）来校准凝血活酶试剂。并将PT以INR的形式表示，INR=（PT/MNPT）ISI，其中ISI为凝血活酶的国际敏感度指数，MNPT为正常人凝血酶原时间的几何均数，这种校准方式大幅提高了手工检测时不同试剂之间的检测标准化。
（二）自动化凝血仪的多样性使报告标准化再次面临困境
INR的方式提高了实验室质量控制的有效性和口服抗凝治疗的安全性，在各大临床指南中都可以发现以INR为监测目标的诊治措施。今天，我们必须明确的是INR概念和校准方式的提出是基于手工方法的，当自动化凝血仪被普及使用之后，INR概念的内涵发生了更为复杂的改变。仪器测试原理与手工法显著不同，对凝血活酶ISI以至INR产生较大的影响而且程度不确定，机械和终点判定等因素破坏了INR体系原有的可靠性和精密度。据文献报道，同一厂家的相同机型对INR的影响都有显著差异，仪器校正显得十分必要。
必须明确：INR是WHO利用IRP标定凝血活酶试剂后，手工测定PT时优化报告的一种方法和理念，这时可以减少室间差异及提高报告的可比性。凝血活酶校准时要求使用参考品和试管倾斜方法判定结果，然而，将商品化凝血活酶在自动化凝血仪上检测标本时，原理发生了改变，这种校准方法的基础已经不复存在了。这时我们校准的不仅仅是凝血活酶，而是包括凝血活酶和检测技术（仪器）在内的整个系统。
如果不用标准血浆校准，数据显示实验室间的INR差异具有显著性，波动幅度（CV%）大约为9～17%，仅60%的实验室在10%以内。即便使用同种试剂，同类型仪器测定的INR也有较大差异。原因之一就是很多研究误以为ISI只针对试剂，实际上，一个固定的ISI未必适合所有机型，如果不考虑仪器差异而泛泛考察可比性，将导致试剂校准和系统校准的混淆。自动化凝血仪的检测系统往往包括几个部分：正常血浆、抗凝患者血浆、凝血活酶试剂、检测技术（手工法和不同类型的凝血仪）。试剂对标本类型差异会产生不同反应，比如，某试剂在自动化凝血仪上与IRP手工法对比测定正常和高值两组标本时，可能回归曲线的斜率很接近，但是截距有差异，也就是试剂相关性较好，但是在不同值段的测定结果有差异。临床实践中不可能对正常和抗凝患者的标本建立两条工作曲线，所以应尽量选择性能表现均一的试剂。
（三）要严格限定试剂ISI的适用范围
为了避免混乱，通过多年研究和专家的倡导，国外制造商已经在其说明书中提供仪器型号特异的凝血活酶ISI，便于用户使用；但是要提供所有仪器和不同试剂组合的ISI显然是不可能的。更让人头疼的是，制造商为每一批凝血活酶试剂提供的ISI不一定很准确，定标血浆使用不当进而导致INR的校准偏差。
凝血活酶制品校准的准确性取决于口服华法令患者标本的数量，WHO推荐的用IRP校准凝血活酶试剂的方法需要测定至少20份新鲜正常血和60份新鲜抗凝治疗的血样。许多厂家难于收集到足够数量的标本，无法得到准确的ISI，受害的不单是实验室，更多的是患者的利益。
是否选用同物种的IRP来校准凝血活酶，也是ISI标注的关键，人源和兔源IRP校准的凝血活酶在检测性能上是不同的。1977年以后WHO陆续改良更新了几个物种和不同级别的凝血活酶参考品，虽然WHO生物标准化专家委员会提出所有商品化凝血活酶都应以同一物种的国际参考品校准，甚至有专家认为应该都以人脑参考品校准，以减少物种之间的差异，但是据笔者观察，多数产品说明书中都没有校准方法的详细表述，这就为单纯追求低成本而不加选择地换用试剂埋下了隐患。
此外还有生物参考范围不同的问题。理论上，使用系统特异的ISI计算的INR应该是相当接近的，然而，由于校准方式不当和生物多样性的存在，INR的值也有出入，比如各实验室MNPT不同，凝血活酶生产商标定自己产品ISI时使用的方法不同等。
这些不利因素就对凝血实验室提出了较高要求，但是自行校准也缺乏可行性。医院测定MNPT还相对容易，但是按照WHO的推荐方法对凝血仪和试剂组成的系统来校准ISI并非易事。多数实验室直接使用了试剂标注的ISI，甚至有的ISI不是针对自己的机型。而且即便是校准了ISI，也只能出来报告之后再编辑程序批量计算校准后的INR。据笔者了解，目前在国内主流机型上通过调整ISI实现系统校准难度较大。因此，要么在实验室信息系统（LIS）中增加数据处理的程序语句，要么计算INR后再手工输入，这种方式推行起来有困难。
（四）止凝血检验中的校准和定标辨析
先是校准试剂，接着又校准试剂和仪器所组合成的系统，但是，我们仍然没有全面考虑到包括测试环境的所有因素。比如说粘度法中磁珠的差异，离心比浊法仪器中离心力的差异，光学比浊中的光径，凝集曲线的特异性，电子和机械部件上差异等等，不一而足，任何因素不一致都会使结果受到影响。任何一种方法的结果都是根据定标曲线和检测信号确定的，仪器之间不仅信号不同，定标曲线更是千差万别。尽管常规工作中的定标通常表述为Calibration，但是这并不是严格意义的校准。定标曲线的建立是为了在本实验室环境下保持检测体系稳定的一种方式，只是一个检测平台，用于保证实验室对某一人群标本测定的一致性。这个过程中没有真正的标准品出现，如果定标血浆未经IRP校准，那么该定标是不能溯源的，定标后的不同仪器未必具有可比性，系统差异的存在也不能通过定标来消除。由于仪器性能上的差异性，简单地用校正因子来调整检测系统的方法是无效的。
APTT的标准化进程更为困难。检测系统类型、接触活化因子以及试剂磷脂成份的差异会导致APTT反应的差异。1995年国际上提议建立APTT标准化的校准模型，而目前还没有适用于APTT的国际标准品，1998年Van Den Besselaar教授提出可以将含有合成磷脂和胶质硅的冻干APTT试剂作为候选的APTT国际标准品。Clauss法Fib定量的定标曲线可以溯源到参比血浆，因此这种方法可以实现标准化, 而PT衍生法是根据浊度变化换算结果，不仅与真实浓度存在偏差而且也不能标准化。
（五）实现止凝血检验标准化过程中的有益尝试
可以说，凝血检验的标准化仍然在不断完善的过程中，一方面我们要强调其必要性，另一方面也需针对实验室的具体条件灵活处理，提出相应的解决方案。大致可以分为以下几个层次：（1）尽可能使用ISI接近1.0的PT试剂，这种情况下可以使用厂家提供的ISI。或者选择厂家标注了本实验室机型相应ISI的试剂，这时也尽量选择ISI较小的剂型。针对特定的仪器和凝血活酶试剂组合，使用系统特异的ISI，系统特异的ISI与单一ISI相比变异性更低，因此选择仪器和试剂时应予以考虑。（2）如果ISI接近2.0而且没有配套凝血仪，又无从获得口服华法林病人的血浆，应该用商品校准血浆调整本室ISI。用商品化冻干质控血浆校准检测系统，需要注意血浆来源，不同凝血活酶试剂对人为消耗生成的低凝血浆和口服抗凝药后患者的低凝血浆是有反应差异性的。使用多个献血员的混合血浆与单一血浆相比可以减少生物变异性，减少线性回归时数据的离散。(3) 用国际标准品使PT标准化。标本的INR低于4.0时，使用厂家标注的ISI和实验室重新校准的ISI计算的INR具有良好的相关性，但是高于4.0时则会产生较大的偏差，这种偏差在临床上会形成足够的临床意义干扰正确的治疗。国外已经出现了多种标注了INR的商品化质控血浆用于确认检测程序，假如所有的凝血活酶制剂都根据WHO推荐的方法正确地校准过，那么用这些凝血活酶测定质控血浆时结果应该是一致的，测得的INR与标注的INR相符，事实上，只有用同一厂家出品的质控血浆和凝血活酶才能得到和标注值吻合的结果。换用其他凝血活酶试剂或者将凝血活酶试剂的ISI重新校准后，INR与标注值相去甚远。因此质控血浆的使用尚需慎重，避免误导用户认为自己的检测系统不准确。比较好的办法是使用20个参照IRP用手工法标定PT值的冻干血浆校准品对实验室检测系统进行校正。
综上所述，可以认为自动化凝血检测系统具有相互独立性，仪器之间不存在标准问题。选择仪器时我们应该考虑那些与手工测定结果接近的和INR变异小的设备。尽管我们一直尝试着校正自动化凝血仪，但是以何为准呢，这个标准就应该是手工参考方法，通过这种方法获得标准品的参考值，再对检测体系加以调整，使仪器测定的INR接近该值。
二、纤维蛋白原的Clauss法与PT衍生法测定差异
纤维蛋白原（Fib）除了诊断低纤维蛋白原血症和溶栓监测等之外，可以作为累及动脉的心血管事件的预测指标，因此用于筛查时就需要足够标准化和良好的重现性，以便于临床判断或解释。选择哪种方法用于纤维蛋白原定量测定可以说是老生常谈了，除了Fib抗原分析之外，在临床常规分析中无疑是Clauss方法，但是目前仍有为数不少的临床实验室用PT衍生法的计算值报告结果，并由此产生了室间质控甚至临床报告的显著偏差，考虑到本刊读者群体对临床实际问题的密切关注，我们简单探讨一下PT衍生法Fib（PT-Fib）与Clauss法之间的差异，以及这种差异可能带来的后果。
从某种意义上说，Clauss法Fib测定是临床凝血检验中唯一能够实现标准化的指标，即便是使用不同试剂在不同仪器上测定，都应具有良好的一致性。当然，前提是在方法学不受影响的前提下，比如光学法仪器测定乳糜标本时，会因为浊度较大发生结果偏差。用clauss法测定参考品或可溯源的质控品时，不同试剂的结果之间一致性非常好，甚至来自于不同实验室的结果之间差异都不显著，从这一点说，参加室间质评时，如果是基于clauss方法，而且在本机上有较好的定标，那么至少Fib这一项是不该失控的。但是临床标本不同于参考品，特别是溶栓治疗的患者标本，其变异性会略高。
临床评估发现，测定高值标本时。与clauss法相比，PT-Fib的测定值偏高，而且对校准血浆有依赖效应，它不仅受标本浊度影响，也会因仪器原理或凝血活酶差异产生较大的离散。PT检测是光散射法还是光密度法，反应终点的判断方式如何，都是造成PT-fib不具有可比性的原因。一般地说，PT-FIB测定结果略高于Clauss-Fib，两者之间呈曲线关系，而且随着FIB浓度的增高，方法之间的差异会有所波动，最大差距甚至可达2g/L。在异常纤维蛋白原血症和溶栓时，Clauss法Fib已经减低时，PT-Fib却仍然表现为正常。不得不提起注意的是，PT-Fib不仅是仪器之间，在同一系列不同型号的仪器之间也存在差异，比如同样是光散射法原理定标测定，如果使用了不同系列的反应杯，就会出现散射光与浓度之间的定量关系发生变化，进而出现结果的不一致性。
除了PT-fib的结果略高于Clauss法之外，还有一个特点，即不同试剂测定的结果相关性非常好，但是有可能一种试剂的结果可能明显高于另一试剂。因此，我们在临床评估时，单一依靠相关性来说明新试剂是否可靠或有效的做法是欠妥当的，起码纤维蛋白原这一定量指标应该引入准确度的概念，也就是说不同试剂测定纤维蛋白原时应该使用Clauss直接比较差异性（因为相关性已经成为前提）。
由于纤维蛋白原浓度减低比增高的临床意义较大也更为常见，因此多数Fib诊断试剂主要针对低水平Fib定量，甚至定标血浆浓度仅略高于4g/L，这就决定了测定高值标本时的灵敏度和特异性是不同的。从这个概念上说，选择FIB定标血浆显得尤为重要，作为临床实验室来讲，不便于获得国际标准品，多数使用的是厂家提供的定标血浆，由此就带来了产品差异性。
Clauss法尚且能够用参比血浆或其衍生定标血浆来保证不同体系测定的准确性，而有些PT-fib是根本不能定标的；甚至个别方法连高值血浆Fib的浓度都不能设定进去，这是因为仪器内部的参数限制，Fib太高用该方法难以得到定标曲线。英国血液学会在纤维蛋白原测定指南中指出：推荐使用Clauss法纤维蛋白原测定。结合我们的临床经验，不推荐用PT-Fib进行试剂或仪器性能比对，特别是在一些重要血栓性疾病时，比如DIC、溶栓、口服抗凝药或高纤维蛋白原血症时，方法学的差异将表现得非常明显。
三、关于D-二聚体的认识及其临床应用
从纤维蛋白原到纤维蛋白形成，在纤溶酶的作用下会降解出一系列的片段，FDP就是评价降解产物多寡的一个常用指标，但是它并不能区别产物是来自纤维蛋白原还是纤维蛋白。在这些降解产物中，由于D-D结构域只能在交联的纤维蛋白肽链的羰基末端之间形成，因此D-二聚体被作为交联纤维蛋白形成的标志物，或者说体内有纤维蛋白凝块形成，D-二聚体与FDP结合分析有助于了解体内纤溶的情况。
（一）为什么不同D-二聚体试剂的测定结果不可比
由于方法学上的原因，不同试剂测定同一份血浆或全血中的D-二聚体浓度往往不具有可比性。原因包括抗体特异性差异，纤维蛋白降解片段长短不一，针对不同片段制备的单克隆抗体也不一样，抗体对同一份血浆中不同片段的结合能力也不同；比浊法测定还受到乳胶颗粒特征的影响，颗粒大小不等在聚集时吸光特性也不一样，因此不同D-二聚体试剂的差异是不可避免的。
除了方法差异之外，D-二聚体定量的单位也有多种表达，比如ng/ml, ug/ml, mg/ml，还有纤维蛋白原当量单位（FEU），数量级相差很大甚至不可比。更为重要的是，文献报道的参考值通常受试人群是不同的，种族、生理、性别和年龄的差异都会造成统计结果的不同，即便使用同一种试剂，检测不同人群时特异性竟然从24%到82%不等。这种方法学上灵敏度和特异性的波动使其应用受到了怀疑，笔者认为，D-二聚体检测结果的差异性应该在充分理解其生理特点和方法学的基础上加以分析，比如，抗体对低分子量和高分子量降解产物的检出能力不同，甚至个别抗体对交联的纤维蛋白和纤维蛋白原的降解产物之间还存在交叉反应等等。
由于每种试剂所用抗体不同，因此相应的校准物也不同，目前校准物包括交联纤维蛋白凝块被消化处理后的血浆，DIC患者的混合血浆，或者高分子量纤维蛋白寡聚体制品等。制造商只选择适合其产品的校准物，但是一种定值校准物不会适用于另一品牌的试剂，因此，D-二聚体测定没有参考标准，方法之间校正的可能性也很低。
（二）如何确定D-二聚体的Cutoff值
由于血栓栓塞不单作为一种独立疾病存在，除了原发性疾病并发血栓之外，外伤和手术等都会造成D-二聚体水平升高，而且年龄和生理病理状态的影响十分显著，毫无疑问，灵敏度特异性和预测价值的不一致性也就由此而生。鉴于D-二聚体测定的方法学差异，在应用上很难实现标准化，也不易制备通用型的标准品或校准物，可行的倒是根据每个体系的检测特性，各自建立具有临床应用价值的Cutoff值，一方面该值应在大规模临床试验的基础上获得，另一方面还应根据检出特征选择适当的灵敏度和特异性来确定该值。由于D-二聚体的价值首先体现在过筛上，因此如果Cutoff过低时，灵敏度过高，假阳性过多就失去了检测的特异性，达不到筛查的效果。而Cutoff过高，假阴性过多，漏诊了深静脉血栓或肺栓塞，后果将不堪设想。Cutoff的选择不应简单照搬厂家推荐值，应该参考在权威杂志发表的有临床诊断价值的实验结果，并在使用之初针对本地人群或患者加以验证。
（三）D-二聚体的量值判断与临床决策意义
静脉血栓包括深静脉血栓（DVT）和肺栓塞（PE），成年人每年发病率约为0.1%，男性略高于女性，其中大约2/3表现为DVT，另1/3为PE。静脉血栓的预后不容乐观，多为死亡、复发、栓后综合征以及抗凝后的大出血，栓后综合征的出现使患者的生活质量产生明显下降，6%的DVT和10%的PE患者出现症状后1个月内死亡，PE死亡率高达30%，原发性静脉血栓病死率较低，而肿瘤并发血栓的死亡率最高。可惜的是，尸检结果表明许多死亡患者临床上并未诊断出PE，因此，提高PE的临床诊断水平对于降低病死率具有重要意义。
血管造影无疑是诊断DVT和PE的“金标准”，但是造影价格相对较高，有侵入性损伤，还受到医院医疗水平的制约。不造影的话，还可以选择肺部扫描和超声，即便不考虑价格因素，这两种方法也不便作为常规筛查，而且真正有PE的患者用一般肺部扫描也只能发现10-20%。因此，临床医生倾向于向实验室申请D-二聚体检测，自上世纪80年代以来D-二聚体就用于静脉血栓诊断的排除诊断，D-二聚体正常或者低于Cutoff值就可以排除DVT或PE的可能了。与血管造影和超声检查相比，D-二聚体测定更为简单便捷，价格低廉。如果临床认为发病的可能性较低，D-二聚体又是阴性就能够安全排除静脉血栓，大大减少进一步的影像学评估。
一种可靠的D-二聚体检测方法诊断PE的灵敏度可以达到99%以上，特异性为40-60%，阴性预测值（阴性时可以确定不发病的几率）达到99%，如果将Cutoff水平由500ug/L提高到4000ug/L，那么D-二聚体的特异性可以达到93%，但是为了避免漏诊，不建议盲目提高D-二聚体Cutoff值。
在诸多D-二聚体测定方法中，普通ELISA法对DVT诊断的灵敏度优于定量和半定量的乳胶凝集，定量快速ELISA优于定量和半定量乳胶法，定性快速ELISA优于半定量乳胶凝集。定量和半定量乳胶凝集以及全血凝集法的特异性优于ELISA，定量和半定量以及定性ELISA。其中，ELISA和定量快速ELISA最具阴性诊断价值（似然比分别为0.12和0.09）。对于PE诊断的灵敏度，ELISE、定量快速ELISA（半定量方法稍差）要高于全血聚集法，但是全血法的特异性独具优势。进一步细分的话，定性快速ELISA优于ELISA，定量和半定量的快速ELISA，定量和半定量的乳胶凝集法。ELISA、定量或半定量的快速ELISA方法具有较好的阴性诊断价值（阴性似然比分别为0.13, 0.13, 和0.11）。
这些方法的性能评价也不能一概而论，只能说总体上有上述关系，不排除通过抗体改进或引进其他技术升级的新产品具有优良性能。
（四）特殊情况下D-二聚体升高造成的两难境地
1、术后D-二聚体升高。患者在围手术期的状态可以概括为术前缺水，术中低血压，术后继续缺水并缺乏必要运动促进血流，加之术前止血和术后抗凝以及手术造成的内皮损伤和组织破坏激活了凝血机制诱发血栓生成。因此，术后D-二聚体升高在所难免，仅凭高于Cutoff值来筛查静脉血栓显然是不够的，积极抗凝结合密切监测有助于预防静脉血栓的发生，由于篇幅有限，相关问题另文再谈。
2、妊娠。妊娠女性发生静脉血栓的风险比同龄非孕妇高3-4倍，其诊断也更为复杂，比如，非血栓性的小腿肿胀疼痛与静脉血栓的鉴别。超声作为诊断非孕期妇女DVT的首选工具，灵敏度和特异性都很高，但是对于孕期常见的髂静脉血栓或小腿静脉血栓并不可靠。因此，检测前的临床判断（PTP）和D-二聚体测定被纳入了可疑DVT的诊断方案。
由于怀孕期间凝血和纤溶系统的同步活化会出现一系列标志物的升高，这就给筛查妊娠女性的静脉血栓带来的困难。据报道，D-二聚体在一般就诊患者中的阳性预测率为18%，但是28孕周以上的妇女检测的特异性和阳性预测率分别降至49%和9%。即便是没有任何并发症的孕妇，其血浆D-二聚体水平也会随着孕龄的增长呈现升高的趋势。临床上，总有一些医生试图得到一个明确答案：D-二聚体到底超过多少时我们开始抗凝？然而，即便是有学者做过此类调查，我们也不能随意地推荐，或者简单地奉行“拿来主义”。何时用何参考值预测孕妇静脉血栓的发生，应该建立一个真正具有指导价值的时间趋势曲线来指导排除诊断或者是抗栓治疗。
（五）D-二聚体能否用于预后
D-二聚体作为独立的栓塞风险预测因子，阴性时复发血栓的风险比阳性者低60%。同时D-二聚体升高比低值或阴性的患者血栓标志物也增高，比如VIII因子，凝血酶原基因突变等，因此可以理解为，D-二聚体水平居高不下一方面是由于纤维蛋白的不断形成和溶解，另一方面，这些标志物的升高为复发血栓提供了充分的物质条件。
除了急性冠脉综合征以外，D-二聚体在如下情况也有潜在的预测价值：急性肠缺血，急性上消化道出血，脑梗塞，动脉纤维化和菌血症等。血浆D-二聚体增高对急性上消化道出血和颅内出血而言预后较差，D-二聚体水平可以作为急性肠缺血时开腹和急性上消化道出血急诊内镜检查的指标之一；脑梗塞时，D-二聚体可用于病因分析。心源性（来源心脏栓塞而没有大血管疾病）和动脉粥样性栓塞（大血管疾病而没有心源栓塞）时，D-二聚体升高，但是腔隙脑梗塞（皮层下小梗塞）时D-二聚体为阴性。近年来对于D-二聚体预后价值的研究多为回顾性分析，样本量较小，定量分析少，而且部分研究将诊断DVT的cutoff值用于预后分析，降低了其应用价值。尽管当前国内D-二聚体的检测呈现迅速增长的势头，与方法学和临床应用相关的问题还很多，还有更多的研究热点等待我们去挖掘。