西游记片段摘抄:中药指纹图谱技术的研究现状及应用--《时珍国医国药》--医学期刊频道--首席医学网

　　关键词：中药；  指纹图谱；  分离分析技术；   评价方法;   质量控制

　　中药作为我国的国粹，有着几千年的悠久历史，是中华民族的宝贵财富，它的疗效已为世人所瞩目。然而，众所周知在我国中药材的质量极不稳定，市场也较为混乱，中药的质量问题已成为中药现代化、国际化的一大障碍。多年来我国中药材的质量控制基本上是以传统的性状鉴别和显微鉴别确定真伪，以理化鉴别评价优劣。前者为定性鉴别，要求鉴定者具备丰富的实践经验，人为因素较大；后者只考虑众多复杂成分中的个别活性成分，而忽略了中药材诸多成分的协同作用。中药是基于其所含多种化学成分发挥综合的医疗作用，因此单凭其中一种化学成分定性或定量的传统中药质量评价方法，其有效性和专属性逐渐受到质疑，多指标的质量标准必定是一种趋势。本文以近几年国内外在中药指纹图谱方面的研究为材料，对中药指纹图谱技术的研究现状及应用综述如下。

　　1  国内外研究现状

　　随着现代分析技术的发展，指纹图谱技术是当今国际公认的控制中药质量的质控模式。它能从原药材的栽培、引种，中成药生产工艺的规范与优化，到产品质量标准的制定提供全方位的质量保证。近年来国外对草药产品的质量评价也在提倡指纹图谱［1，2］，随着各种分析技术的创新和提高以及计算机应用技术的不断发展，世界各国对天然药物的了解和研究在不断深入，中药指纹图谱技术在国内外已成为一种发展趋势,其研究的方法和技术更趋成熟完善，成为国际公认的控制中药和天然药质量最有效的方法和手段。日本汉方药在20世纪80年代就采用高效液相指纹图谱控制质量［3］。欧共体也将指纹图谱监控技术应用于植物药质量控制，美国食品药品管理局允许草药保健品申报资料时提供色谱指纹图。世界卫生组织在 1996 年草药评价指导原则中也规定：如果草药的活性成分不明，可以提供色谱指纹图以证明产品质量的一致性。在英国、印度、加拿大等国家在植物药的研究中，也对指纹图谱十分重视。在许多国家的药典中，色谱指纹图谱已成为主要的分离分析方法。而我国药典的中药部分，这一分析技术还未占主导地位。在医药科技“十五”计划中，重点提出解决中药材质量规范化问题。2000年国家药品监督管理局颁布了《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）》，要求中药注射剂必须进行指纹图谱的研究，并建立其相关的标准。规范了中药指纹图谱的研究，从而促进了国内近几年来对指纹图谱的研究热潮。而国外许多研究机构对中药指纹图谱的研究主要为建立指纹图谱与药效的相关性研究，是以中药理论和新药开发研究体系为主的模式。我国对中药指纹图谱的研究尚处于初级阶段，与发达国家相比有一定差距。目前主要为使用各种方法建立中药材及制剂的指纹图谱，以及对相应信息进行数字化处理，使其能够评价和控制中药材及制剂的质量。

　　2  构建指纹图谱的方法

　　2.1  薄层色谱法（TLC） 薄层色谱具有选用范围广,重现性好等优点，常用于中药各种成分的鉴别。用固定波长对薄层展开的各斑点作薄层扫描图谱比目测的层析图谱更为客观准确，因而具有更好的指纹鉴别意义［4］。但由于受薄层板的质量和开放式层析系统等外界因素的影响，易引起一定的实验误差。

　　2.2  气相色谱法 (GC)  气相色谱是封闭性色谱，受外界影响较少，具有高性能、高选择性、高灵敏度等优点，适合于药材及制剂中挥发性成分指纹图谱的研究。一般使用质量型检测器-氢火焰离子化检测器（FID）。钱浩泉等［5］用气相色谱法建立了高良姜及其边缘植物挥发油成分的指纹图谱。具体应用中多与质谱联用，不仅具有 GC 的高分离效能，而且兼备了质谱鉴定的高灵敏度和准确性。

　　2.3  高效液相色谱法 (HPLC)  高效液相色谱具有分离效率高，分析速度快，定量精密度高，检测器种类多，稳定性好等特点。不受样品挥发度和热稳定性的限制，比气相色谱法应用范围更广，样品中大多数成分均可在高效液相色谱仪上进行分析检测，是构建指纹图谱的主要方法之一。由于中药成分的复杂性，构建指纹图谱一般采用梯度洗脱，因为逐步提高流动相洗脱能力可获得较多色谱峰，提供更多指纹信息。在考察条件时，要对指标成分和非指标成分都予以考虑，由于药材中各种成分的吸收波长及对不同检测器的响应不同，在构建指纹图谱时也需要加以考虑。实际应用中多使用多种联用技术，充分利用各检测器的互补性，从不同角度反映药材及制剂的全貌，从各种图谱中得到结构信息。

　　2.4  高速逆流色谱法 (HSCCC)  它是目前国际上较新型的液－液分配色谱技术，利用相对移动的两种互不相溶溶剂，在处于动态平衡的两相中将具有不同分配比的组分分离。已有报道［6］将 HSCCC应用于生物碱、黄酮、木脂素、蒽醌等天然产物的分离分析。具有分离效率高，溶剂用量少，无吸附，样品回收率高,重现性好和适用范围广等优点。

　　2.5  高效毛细管电泳法 (HPCE)  高效毛细管电泳技术是以高压电场为驱动，毛细管为分离通道，依据样品中各组分淌度和分配行为上的差异而实现高效快速分离的新型电泳技术。毛细管电泳的广泛应用取决于其多变的分离模式，几乎涉及分析化学中所有的分离对象，小到无机离子，大到蛋白质和高分子聚合物，也能够分析不带电荷的中性物质［7］。具有所需样品少、溶剂消耗少、抗污染能力强、可直接分析水溶液等优点。其中毛细管区带电泳 (CZE) 和胶束电动毛细管电泳色谱 (MECC) 是中草药分析中最常见的两种模式。但该方法的重现性有待提高。

　　2.6   紫外可见光谱 (UV)  紫外可见光谱反映不同化学物质的电子共扼体系特征，具有加和性，对于混合物的鉴别专属性差，分辨率低，故紫外光谱很少用于指纹图谱的构建。

　　2.7   红外光谱和近红外光谱 (IR)  红外光谱是由分子的振动－转动能级跃迁产生的光谱，红外光谱具有高度的特征性。近红外光谱法在中药质量控制方面有较好的应用前景。

　　2.8   核磁共振法 (NMR)   从纯有机化合物的核磁共振氢谱上可获得结构信息，包括各类质子的化学位移、数量核偶合关系。核磁共振谱具有高度的重现性和特征性，易于解析和进一步研究，可评价药材和中成药质量的均一性和稳定性。

　　2.9  质谱法 (MS)  将中药提取液置质谱仪中进行电子轰击电离，可获得提取液中化学成分的质谱指纹谱，不同中药提取液所含成分不同，所得质谱图显示的分子离子峰及进一步，裂解碎片峰不一致，可供鉴别。

　　2.10    X射线衍射法  物质被X射线照射可产生不同程度的衍射现象，只要某一混合物的组成是恒定的，其衍射图谱可以作为该混合物的特征图谱。该法具有图谱指纹专属性强，信息量大,所需样品量小等诸多优点，X射线衍射法在动物类药材鉴定与辨别中有独特的优势［8］。

　　2.11   分子生物学法 (DNA) 利用聚合酶链反应从不同生物样品中人工合成 DNA片断，而这种 DNA片断的大小、数目可因不同的生物而异，故称之为 DNA指纹图谱。该技术具有重复性好、灵敏度高的优点。限制性内切酶片段长度多态性（RFLP）是最常用的构建 DNA指纹图谱的方法，但该法费时费力，应用受到限制。随机扩增多态 DNA（RAPD）标记，可以在特异 DNA序列尚不清楚的情况下，检测DNA的多态性，这是构建中药指纹图谱的新方法，具有极好的应用前景。 罗志勇等［9］采用 RFLP技术,分析了人参、西洋参基因 DNA指纹图谱。

　　3  解析指纹图谱的方法

　　中药的指纹图谱大都比较复杂，尤其是复方中药。如果用人工对其进行分析，找出其图谱特征并分析药品质量，容易由于人的主观因素，做出不同判断，造成结果误差。此外色谱图中各色谱峰的保留值易受各种因素的影响，包括一系列的操作因素和实验条件存在的差异，都给指纹图谱的分析带来困难。解决这一难题，需要对大量的仪器分析数据进行处理，从中提取化学特征信息，进而实现化学模式识别［10］。

　　3.1   相似度评价法   相似度可以量化描述指纹图谱相似性，即客观地数字化描述。相似度分析常采用的方法是相关系数和夹角余弦。相关系数［11］是测度样品间在特征变量的变化模式上相似形状的相似度，它忽略了变量值大小之间的差异,可鉴别样品真伪，提供定性信息的相似度。夹角余弦法是在多维空间向量夹角的基础上,计算样品指纹图谱特征向量与共有模式向量之间的夹角余弦相似度,可以提供样品真伪相似性的信息。王龙星等［12］用向量夹角法，利用计算机对11个不同产地及炮制方法的吴茱萸样品的液相色谱指纹图谱分析，结果表明能较好地定量评价指纹图谱间的相似性，并能够区别炮制方法对指纹图谱的影响。

　　3.2   模糊聚类分析聚类分析是近十年来发展起来的一种新的数学方法，是研究事物分类的有效方法。中药的质量具有模糊性，图谱的相似性只有相对的意义。对于这种具有模糊性的问题，使用模糊分析显然比较合适。当前在指纹图谱分析方面，使用较多的为模糊聚类分析。聚类分析应用于指纹图谱，注意力应放在聚类类别数的决策和聚类结果的解释上，具体类别数和聚类结果任何解释要靠深厚的中药知识和认真分析。 田兰等［13］采用聚类分析和逐步判别分析对白术高效液相色谱进行化学模式识别研究，根据识别结果，初步建立了评价白术真伪优劣的新方法。

　　3.3   人工神经网络法  人工神经网络法是一门崭新的信息处理方法，已在许多科学领域中广泛应用，这种方法具有分布存储、平行计算、容错和自适应能力，可用于模式识别、数据处理、预测、分析组效关系等，使其在测量数据的特征提取中占重要地位。反向传播模型（BP）是目前应用最广泛的人工神经网络模型，具有判别分类可靠性大，速度快等优点。汤丹等［14］建立了广藿香 GC-MS指纹图谱解析的人工神经网络模型，并通过BP网络对不同产地广藿香的识别，证明其有较好的识别功能。

　　3.4  主成分分析  该方法是将分散在一组变量上的信息集中到某几个综合指标（主成分）上的探索性统计分析。该法具有变差最优、信息损失最小、相关性最优等特点。余杰等［15］通过主成分分析和空间投影变换方法获取中药材质量的特征指纹图谱，对野生、栽培桑白皮及其伪品共42个样品进行了测定。结果表明，样品鉴别的准确率达到90.5％。

　　4  指纹图谱的应用

　　4.1  鉴别中药材真伪  中药材的品种鉴别是用药的重要问题，尤其是植物药，同一科属中都含许多品种，能入药者往往只是其中几种，不同品种间质量差异很大。王树春等［16］采用X射线衍射傅里叶谱分析法识别比较了熊胆与伪熊胆、天然熊胆与引流熊胆汁干燥品的区别。

　　4.2  评价中药材质量  中药指纹图谱可用于中药研究、生产的各个阶段的中药材质量控制，中药材指纹图谱的制定对与中药材GAP基地建设、中药材种植规范、选择优良资源和药材道地性研究均有重要意义。

　　4.3  中成药的质量监控  中药指纹图谱可作为中药制剂的质控指标，用以评价产品质量及稳定性，评价生产工艺的合理性。魏刚［17］采用 GC-MS对醒脑滴鼻液、醒脑注射液等复方制剂的研究，以其出峰先后及相对含量为特征，构建了复方制剂的 GC-MS指纹图谱。中药指纹图谱可作为提高中药复方制剂质量标准的有效途径之一。

　　4.4  为中药产业的国际化带来新契机   指纹图谱为中药质量控制提供了新的发展方向，中药质量的量化进入新的层次。随着全球经济一体化进程的不断加快和中国加入世贸组织，给中药产业带来巨大商机。目前，我国中药产值在全球植物药贸易中仅占大约7％的份额，而“洋中药”却长驱直入。其重要原因是药材质量不稳定，没有用现代化药学技术多指标控制的综合评价体系。实施中药指纹图谱质量控制技术，可提高中药质量评价技术的科技含量，对中药的规范化、标准化、产业化和国际化提供科学的技术平台，使其尽快与国际接轨，有利于扭转中药的国际贸易“逆差”，使中药产业逐渐得到国际社会的承认，为中药产业的国际化带来了新的契机。

　　5  面临的问题

　　在实际应用中，中药指纹图谱还面临许多问题，主要有四点：一是中药来源的混乱无序，指纹图谱研究首先需要解决这个源头问题。中药材作为一种天然产物，受品种、产地、生长环境、种植管理、采收期、炮制加工方法等多种因素影响，难以控制，不同药材其指纹图谱有一定的差异，不利于指纹图谱的应用。因此在制定标准指纹图谱时，所选取的药材来源及成药的工艺应相对稳定，有足够的代表性，同时保证质量，才能保持标准指纹图谱的先进性和代表性；二是新技术的应用还不够前沿，对于中药这样一个复杂体系，需要解决分离与检测两大问题，而采用单一分离模式勉为其难，采用传统的检测手段或单一联用技术也易丢失大量信息；三是由于实验室条件，仪器设备的不同造成指纹图谱差异，从药材提取分离到分析检测全过程的标准化、规范化程度不够，影响实验室之间的重现性，难以推广。应在实验条件和仪器进行规范的条件下建立“标准图谱”；四是对大量信息的化学计量处理方法还不够完善，指纹图谱的特征性不够明确具体，指纹图谱与药理作用的相关性缺乏研究。在药理方面，隋因等［18］用血清指纹图谱研究红花对豚鼠离体心脏的作用，为研究中药复方有效化学成分与药理学之间的联系，提供了思路。