九乡新闻网马关赔款:浅谈GC-MS在香气香味分析中的应用--仪器信息网2
来源：百度文库 编辑：九乡新闻网 时间：2024/04/27 22:14:24
香气香味化合物是一类非常复杂，数目庞大的物质。存在的浓度范围很宽，从百分之几以上到ppt以下不等。化学性质，结构都各不相同，有非极性，也有极性很强的。有的香气香味物质的浓度虽然很低，但它的气味很明显。一般要分析的基质也很复杂。举几个简单的例子，比如中国白酒里面含有几百种微量香味成份，如酯，醇，酸，醛，酚，吡嗪等。含量幅度相差很大，可以从每百毫升中几百毫克到几毫克，甚至到ppb级。香精油是通过蒸馏，萃取，压榨，吸附的方法从植物的花，叶子，果实，根部等个部位提取的芳香成分，其组成极其复杂。各种食品材料散发的各种香气。在各种食品，药品中加入各种香味成分。在化妆品，洗剂用品加入的各种香气成分。这些香气香味成分都很复杂，其种类、结构都相差很大。分析难度大。
幸运的是大多数香气香味化合物具有挥发性或半挥发性，所以气相色谱为首选方法。绝大多数香气香味化合物分析可由气相色谱来完成。少数非挥发性，热稳定差，极性太强的物质可以用衍生化方法来进行分析或用HPLC来分析。
毛细管气相色谱对复杂化合物具有高效快速的分离能力。其定性的主要方法是靠利用保留时间(或保留指数)的不同来确定。但许多化合物的保留值都相同。既是非常高效的色谱柱，也不可能在一根柱子上分离所有化合物。总有共流出的时候。各种化合物的保留时间不可能是唯一的。这样看来仅用保留时间来定性化合物有局限性。
质谱可对未知化合物进行结构鉴定。但要求样品或化合物的纯度越高越好，因为杂质造成的本底对样品质谱图产生干扰，对质谱图的解析不利。混合物必须先分离成单一成分，获得纯化合物，再进行质谱测定。气相色谱法对混合物能进行有效的分离，可以提供纯度高的单一组分化合物，正好满足了质谱鉴定的要求。
气相色谱和质谱结合起来，相互补充，充分发挥了气相法高效快速的分离能力和质谱法定性优势。对分析复杂的香气香味物质为首选莫属。
用气相色谱质谱联用分析香气香味物质，包括三方面的内容：
1. 硬件及分析条件的选择。
2. 数据处理。
3.样品准备。
有关的仪器设备，首先是要有GC和GC-MS联用仪，以及各种辅助设备，如进样系统，样品前处理设备等。
对GC-MS联用仪，毛细管气相色谱是少不了的，质谱一般采用带EI源的四级杆质谱仪。
EI质谱能提供有机化合物最丰富的结构信息，是化合物的“指纹谱”，有较好的重复性。通过对单分子裂解规律的研究，已总结了较完整的图谱解析方法。有成熟含有大量化合物的标准谱库供检索。四极杆滤质器的优点是扫描速度快，灵敏度高。（如果有条件的话，也可配置其它的软电离源，如化学电离源CI，以及配置其它质量分析器，如离子阱，飞行时间或多级质谱等的仪器。这样可以得到待测化合物的更多信息，以利于质谱解析等。）
另外可单独配置气相色谱仪，并带FID等检测器。用于色谱分离条件的摸索实验及定量测定等工作。也可在GC-MS联用仪上配置FID检测器用作定量。现在有的供应商的仪器可以同时得到MS和其它检测器的信号。最好在一根色谱柱后面通过分流装置，同时得到质谱总离子色谱图和FID色谱图。这样从质谱的定性结果很容易转移到FID进行定量。
与GC-MS联用仪配套的自动进样系统，例如能够全自动进行液体进样，静态顶空，动态顶空（吹扫富集），固相微萃取，固相萃取，热脱附等样品前处理的附件。大体积冷却进样器等。
样品前处理设备：全自动连续液液提取仪，同时蒸馏/萃取仪，固相微萃取装置，固相萃取装置等。
分析条件的选择
了解样品的来源，性质，极性，沸点范围等信息。向同行咨询，查询已发表的相似应用的文献。根据样品的组分的性质，文献资料和分析要求，拟定分析方案。
一般一种材料里含有许多香气香味化合物，少则几十种，多则几百种，加之香气香味化合物本身非常复杂，有各种结构，不同性质的物质。有时最后所采集的色谱质谱里包含的信息量很庞大。要快速准确对数据进行处理是一件不容易的事情。数据处理一般包含下列组件：
• MS ChemStation 质谱化学工作站，采集数据等。
• Data Analysis (DA) 数据分析，对采集来的数据进行分析等。
• MS Library Search 质谱谱库检索
• MS Interpreter 图谱解析
• AMDIS, GC/MS Deconvolution自动化质谱图解卷积和鉴定软件
• Retention Index Calibration （RIC) 保留指数校正
• Quantitative Analysis (QA)/Report 定量分析/报告
定性分析
定性分析，就是要确定分析样品中有什么成分。也就是要确定各个色谱峰代表什么化合物。对色谱峰的质谱图的检索解析及其核对等。并标注在图谱上等一系列工作。
谱库检索
谱库检索是香气香味化合物定性的一个重要手段。首先要求有较大完整的质谱数据库（MS database或MS library）。目前主要使用的商业质谱库有NIST和Wiley。其中NIST05，NIST08还包含NIST检索，AMDIS，部分化合物的保留指数数据库等。虽然它们收集几十万张标准质谱图或化合物，但收集的香气香味化合物不够全面，特别是近几年新发现的香气香味化合物，新合成的香料化合物没有收入。另外，也有出售香料香精专用质谱库，如FFNSC(Flavor & Fragrance Natural & Synthetic Compounds)等。 有的公司或研究机构有自己的香气香味化合物专用谱库，但一般不对外，属于保密知识财产。另一种办法是自己建立谱库，当然这是件费功夫而辛苦的工作，还要有足够的标样。标样可以从试剂公司或香料供应商购买。有纯度高的标样最好。如果无法得到很纯的标样也无太大关系，因为可以利用GC/MS中色谱分离的优势得到纯物质进入质谱而获得标准质谱图。也可以从天然物等来分离提纯标样。自建谱库的另一好处是，由于用自己的仪器类型和相同操作条件得到的质谱图，使用时匹配度很好。
谱库检索软件
现在的质谱工作站的数据分析本身，以及像NIST等其他专业谱库检索软件的功能很多。例如，质谱数据查询：化合物的基本信息，分子量，分子式，化学结构等。质谱图比较：未知化合物与谱库中标准谱图进行比较，差别比较。图谱分析：计算分子量，同位素比例，分析碎片离子。正向检索，逆向检索等。
测定样品时，仪器已经正确的调谐过，仪器处于最佳状态。数据采集的质量范围要合适，例如有人为了减少氧，氮，CO2离子对基流的影响，从45开始扫描，这样会使质谱图上没有如29，30，31，42，43等离子，使与标准质谱图检索时匹配度过低。如果扫描范围过大，则扫描速度慢，MS文件也太大。背景扣除要正确。
图谱解析
对所测样品，应尽量多了解。知道来源，
对于谱库中无法检索到物质。从碎片离子，分子离子，丢失的碎片，特征离子，同位素等信息仔细分析判断其化学结构。详情请参考有关质谱解析的资料。
有些未知化合物，需用制备气相色谱收集流分，用紫外光谱，红外光谱，核磁共振等方法鉴定结构。
MS鉴定未知物最常用的办法就是未知物的质谱与质谱数据库中标准谱图进行对比。基于相似度，检索功能可提供一个按相似系数由高到低的匹配列表。相似度越大，检索的正确的可能性就越高。正如众所周知，充满挥发性香气香味成分的植物的提取物，香精油等天然材料的复杂机体含大量的萜（烯）化合物，即由异戊二烯单元组成烯类及其含氧衍生物，如醇类，醛类，酮类，酯类，醚类，氧化物等。其质谱裂解出非常相似的碎片，用质谱数据谱库PBM检索就难以识别。例如，甲位蒎烯和乙位蒎烯这两个异构体的质谱图非常接近，在PBM检索时，给出的结果可能把甲位判断成乙位。再例如，柠檬醛的两个异构体橙花醛和香叶醛，橙花醇和香叶醇等等也有同样问题。许多醇和及其酯的大部分离子碎片也相同。脂肪醇和直链烯烃的质谱图非常相似。三个二甲苯的邻，间，对异构体也非常相似。有时候，即是匹配度很高，也无法断定检索的结果是否正确。有时候检索到的几个化合物的匹配度都很高，也很接近，究竟选哪一个呢？对于异构体，同系物和结构特征相似的化合物，由于其质谱图非常相似，谱库检索结果匹配度，排列次序都很接近，检索给出的顺序也不一定正确。但它们的保留时间可能会不同，但保留时间只能在特定色谱条件下不变，而保留指数在固定相相同下有可比性。所以在谱库检索的基础上，用保留指数来确认结果。是一种很重要的手段。
下面是甲位蒎烯和乙位蒎烯这两个异构体的质谱图，差别不大：
上面几个质谱相似化合物对例子的保留指数差别如下表。
下面简单介绍一下AMDIS：AMDIS 软件由美国国家标准技术研究院（NIST）（National Institute of Standards and Technology）提供。
The Automatic Mass Spectral Deconvolution and Identification System (AMDIS)
自动质谱图解卷积和鉴定系统软件(AMDIS)让您从GC/MS数据文件自动找到目标化合物。软件先对GC/MS数据文件解卷积寻找所有分离组分。每一组分与目标化合物的谱库进行对比。如果以上的用户设定值，然后报告出目标图谱和解卷了组分的图谱的匹配因子
。
什么是解卷积（Deconvolution）?
NIST AMDIS的定义:“这里所用的术语在广义上是指从一个复杂的混合物中提取信号。 解卷积的过程包括处理噪音、校正漂移、从紧密相邻的共洗脱峰中提取出单个峰等。” (简单讲就是去复杂化) 用下面的简图可以解释解卷积过程:
在GC/MS 中，Deconvolution是一种数学技术，它可以将重叠的质谱图“分开”成为“清晰”的单个组分的谱图。图1 是这个过程的简单示意图。这里分别是总离子流色谱图(TIC)和质谱图。与常见的情况一样，这个色谱峰包含了多个重叠在一起的组分，而最高点质谱图实际上也是这些组分的组合图。质谱谱库检索只可能给出一个较差的匹配，而且不能识别所有构成这种组合谱图的单个化合物组分。
左边是TIC上某一峰的质谱图。右边是经过解卷积处理后，让目标化合物从基质和干扰物分离出来。得到3张质谱图。很明显，这样干净而纯的质谱图非常有利于PBM质谱谱库检索或其它谱图检索解析工具。这样对共流出的度组分，大峰中小成分，基质掩盖的痕量组分分析度很有利。 另外，AMDIS可以进行保留指数校正。 下面AMDIS的核对窗口显示不同的区域： 最上面的是总离子色谱图，第二是目标离子轮廓图，第三是原始色谱图和提取色谱图的，最后的是数据谱库和提取色谱图的比较。
AMDIS 软件的详细内容，请参考有关使用手册。 下面是某白酒样品在PEG-20M色谱柱上的总离子色谱图（一小部分）。 其中乙酸乙酯（4.028分钟）的峰与少量甲醇（4.028分钟）的峰相重叠（后面是乙缩醛，4.254分钟）。直接用PBM检索无法看到甲醇。经过AMDIS处理后，痕量甲醇就能够出现。
如果能够将AMDIS和保留指数校正等方法结合起来，就可以得到更为准确或更多的检索信息。并能提高检索效率。定量分析
由于FID的动态线性范围很宽，香气香味样品一般用气相色谱FID来定量。而不用质谱总离子(TIC)来定量。除非对非常痕量的成分，可选用选择离子(SIM)来定量。因为通常要同时分析多个香气香味组分，一般采用内标法定量。对某些样品，例如香精油，一些可全部在气相色谱上出峰的香精样品，也可用归一化法进行考察或进行质量控制。对高纯度的香料，可用归一化法测定其纯度和杂质。对于非常痕量的组分或基质复杂时，用选择离子(SIM)来定量不失为一个好的选择。 如果没有独立气相色谱仪，用SIM来定量，不用TIC来定量。离子色谱图比TIC的基质效应小，且信噪比（S/N）高. 所以离子色谱图能给出更稳定的定量数值。但同时要对多个香气香味组分进行定量，每个化合物要选择其定量和特征离子，还要制作定量校正表，很麻烦。
四、样品处理
样品制备是香气香味物质分析中的重要环节，它一般包括从样品中提取香气香味化合物(包括去除样品中的干扰性杂质的分离净化)、浓缩提取液等步骤，是将待测样品处理成适合GC/MS的检测溶液的过程。
有各种各类样品，其基质和香气香味物质化学组成极为复杂，要能适合GC/MS分析，必须对样品进行细致的提取、浓缩和净化处理。样品制备在香气香味物质分析中是耗时、费力的过程。其效果好坏直接影响到分析结果的准确性，而且还影响GC/MS仪器的工作寿命。在提取过程中要求尽量完全地将香气香味组分从样品中提取出来，同时又尽量除出基质和干扰性杂质。当样品中香气香味含量很低时，常常通过增大样品量和浓缩提取液来达到仪器检测限的要求。
用GC/MS 分析时，样品组分必须为挥发性，无纤维，无油脂，无碳水化合物（糖）类，无蛋白质，有足够量，不含水，基质的峰不干扰香气香味成分。一般能满足直接进样的样品不多，通常样品净化非常需要，也很重要。如果没有良好的样品提取方法，就无法获得足够的，准确的待分析的香气香味成分进行GC/MS分析。
样品提取原理
如何从基质中分离待测香气香味成分？一般从下面三个方面考虑：
•从挥发性(沸点)考虑，采取蒸馏的方法。
•从极性(溶解度)考虑，依据“相似相溶”原理，采取溶剂萃取的方法。
•从功能团的相互作用考虑，采取吸附的方法。
香气香味物质分析中常用的样品制备方法有以下几种：
SHS static headspace extraction静态顶空萃取
DHS dynamic headspace extraction动态顶空萃
（吹扫捕集提取(purge-and-trap extraction)）
LLE liquid/liquid extraction液－液萃取
SDE simultaneous distillation/extraction同时蒸馏/萃取
SPME solid phase micro extraction固相微萃取
SPE solid phase extraction固相萃取
TDS thermo desorption热脱附
SBSE stir bar sorptive extraction搅拌棒吸咐萃取
SFE supercritical fluid extraction超临界萃取
SE/ASE Soxhlet extractor索氏提取法
Automatic Soxhlet Extraction自动索氏提取
SLE solid-liquid extraction 固液提取
MASE Microwave-Assisted Solvent Extraction微波辅助溶剂萃取
MonoTrap 固相萃取整体捕集器
PTV 大体积冷进样萃取富集
浓缩：
有减压旋转蒸发法、K-D浓缩法、微型柱浓缩和氮气吹干法等。
衍生化法
非挥发性，热稳定差，极性太强的物质可以用衍生化方法来进行分析。
4.1 直接进样或溶剂稀释进样
此法仅适用于样品不含水，不含油脂和其它的非挥发性物质，待分析的组分有足够量。例如，香精油的分析。如果组分的含量太高，可选用适当溶剂溶解再进样。例如，某些香料的分析。下面为柠檬油和白酒直接进样分析的例子。
4.2液－液萃取
液－液萃取是最常用，最普通的一种提取方法。一般最简单的设备就是采用分液漏斗。常采用少量多次的萃取方法。有条件的话，可采用全自动转盘式连续液液提取仪。后者的设备费用要高些，萃取时间较分液漏斗长，但萃取效率高，节省人力。
优点：容易操作，设备不贵，重线性好，热效应少，适合于水质样品或水溶性溶剂样品，放大倍数高。
缺点：浓缩时易挥发组分有损失，极性化合物回收率低，易乳化，可能由于氧化有新物质形成等。遇到乳化时，可加入NaCl，Na2SO4盐类（轻溶剂时）电解质，离心或超声波（易燃溶剂不适用），延长静止时间，慢转动，适当加温等方法破乳。
一般常用的提取溶剂有乙醚、正戊烷、二氯甲烷等。但是，根据蒙特利尔公约，在分析化学实验中要逐步取消含氯溶剂的使用，如二氯甲烷等用其它溶剂替代。
下面是连续液液提取仪的示意图。 左边烧瓶中加入样品和水。右边烧瓶中加入提取溶剂。溶剂加热后进入冷凝管，冷凝后流入样品瓶。溶剂萃取样品中组分后，通过相分离又回到溶剂瓶。反复数次，最好把样品中的组分转移到溶剂中。
图 连续液液提取仪示意图
图 某桃味果汁的液液提取的质谱总离子色谱图
3.3同时蒸馏/萃取
优点：容易操作。设备不贵。重线性好。适合于水质样品或水溶性溶剂样品和含蛋白质，油脂等样品。放大倍数高。
缺点：浓缩时易挥发组分损失。极性化合物回收率低。可能由于加热，基质分解有新物质形成等，如糖类生成糠醛，油脂分解为低碳醛等。
一般常用的提取溶剂有乙醚、正戊烷、二氯甲烷等。
下面是同时蒸馏/萃取仪的示意图。样品和水加入到左边的烧瓶，提取溶剂加入到右边的烧瓶。两边加热后，样品中的挥发性组分由水蒸汽帯到中间，并与溶剂在中间交换萃取后，在进行相分离，溶剂帯样品中的组分进入溶剂烧瓶，而水又回到样品瓶。反复数次后，样品中的挥发性组分就进入到溶剂瓶。
图 同时蒸馏/萃取
同时蒸馏/萃取应用例子：
烤烟烟叶中加入香料烟浸膏，有改善烟叶的香气，减少刺激感等作用。但由于浸膏类物质一般不能直接进行GC或GCMS分析，需要前处理。下面是通过同时蒸馏/萃取后香料烟浸膏的总离子色谱图。
图 香料烟浸膏的总离子色谱图
固相微萃取主要针对有机物进行分析，根据有机物与溶剂之间“相似者相溶”的原则，利用石英纤维表面的色谱固定相对分析组分的吸附作用，将组分从试样基质中萃取出来，并逐渐富集，完成试样前处理过程。在进样过程中，利用气相色谱进样器的高温将吸附的组分从固定相中解吸下来，由色谱仪进行分析。
简单，快速，集采样、萃取、浓缩、进样与一体。适用于几乎各种复杂基质体系中的挥发性物质的测定。高萃取率。复杂混合物的定量较难。单一或少数定量尚可以。典型应用：样品比较和筛选，挥发性和半挥发性的测定等。
固相微萃取应用例子:
SPME/GC/MS，SIM(选择离子检测)，2ppt 水中土气,人参味化合物， 如2-异丙基-3-甲氧基吡嗪。这里关键是用顶空固相微萃取和选择离子检测，灵敏度很高。
3.5 固相萃取
特点：快速，易操作，成本不太贵。适用于含水，碳水化合物，乙醇等样品。例如清澈的果汁，水溶性香精等。回收率和重复性好。溶剂消耗很少（1ml）。不适用有纤维，浑浊，有油脂，蛋白质的体系，除非通过前处理除去或净化。
溶剂浸提法：将粉末样品，固体样品研碎（有时需冷冻，氮气保护等）后置于烧瓶中，加入一定量的提取溶剂，静止或用振荡器振荡提取数次，每次时间多在0.5~1h，有时也需要更长时间，例如可能过夜。过滤出溶剂后，再用溶剂洗涤滤渣一次或数次，合并提取液后进行浓缩净化。这一方法可用于粉末状，固体或部分膏状样品等。
3.7 索氏提取法
可用于从天然产物等干性材料中提取挥发性或半挥发性化合物。
3.8 静态顶空萃取
主要测定高挥发性组分的测定。
典型应用：乙醛，残留溶剂等的测定。
3.9 热脱附
先将化合物收集在合适的选择性吸附剂（如Tenax）中，达到所需的量后再进行热解吸，转移至色谱柱上。这种方法也可用于固体和液体样品中挥发性组分的提取（加热的动态顶空提取或气提法），然后再直接进样或通过一吸附/解吸装置，例如有一段填充衬管的PTV进样器，将待测组分转移到色谱柱上。
热脱附具有高灵敏度，不需要溶剂，萃取时间短，需样品量少，极性和非极性挥发物有
良好的回收的特点。 但重复性差，设备昂贵。
可用于各种基质的样品，例如茶，香辛料，食物中的挥发物的提取。
3.10 搅拌棒吸咐萃取
搅拌棒吸附萃取，是将涂有聚二甲基硅氧烷(1mmd.f.)的一小的搅拌棒(10-20mm长, 1.3mmOD)直接插入样品中，搅拌约1小时。在搅拌过程中，待测物提取进入作为固定液的PDMS相层中。然后，取出搅拌棒，用蒸馏水清洗表面，放入热解吸装置中。由于PDMS具疏水性，因此可省去干燥这一步骤。加热搅拌棒，将提取到的化合物转移至GC-MS系统中，进行分析测定。整个操作可得到很低的检测限（10-12级）。比固相微萃取灵敏。
SBSE 应用：多果味饮料
这些饮料是由果汁或是果汁的混合物、果汁浓缩液、自然或人工合成的果味香精，用水或苏打水、矿泉水稀释而成。
图 多果味饮料，HP-5柱，30m×0.25mm×0.25μm，分流比1：20，Twister（Gerstel）
表 多果味饮料，化合物列表
3.11 MonoTrapTM 固相萃取整体捕集器
MonoTrapTM是集硅胶、活性炭、ODS特性为一体的高交联性新吸附剂。可用于极性和非极性，高沸点和低沸点化合物的提取。即可用少量有机溶剂萃取，也可用热脱附共色谱分析。
面是白酒MonoTrap搅拌，有机溶剂萃取的例子（岛津资料）：
1 Ethyl pentanoate，2 1-Butanol，3 Isopentyl alcohol，4 Ethyl hexanoate，
5 Hex-5-enoic acid, ethyl ester，6 Propyl hexanoate，7 Ethyl heptanoate， 8 Ethyl heptanoate，
9 Ethyl laceate， 10 1-Hexanol， 11 Butyl hexanoate，12 Ethyl octoate，13 Acetic acid，
14 Furfural，15 Isopentyl hexanoate，16 Pentyl hexanoate，17 Octanenitrile，
18 exyl hexanoate，19 Butanoic acid，20 Pentanoic acid， 21 Hexanoic acid，
22 Ethyl dihydrocinnamate，23 Heptanoic acid， 24 Ethyl tetradecanoate，
25 Ethyl hexadecanoate，26 Ethyl Oleate，27 Linoleic acid ethyl ester，28 Dibutyl phthalate，
29 Octyl phthalate
3.12 大体积冷进样萃取富集
可以用溶剂吹扫进行简单快速富集
3.13 浓缩
由于要想检测到样品中的量非常少的香气香味物质，用溶剂提取法，如液－液萃取，同时蒸馏/萃取和固液萃取所得到的溶剂提取液进行浓缩。使检测溶液中待测物达到GC/MS灵敏度以上的浓度。有的提取方法，如固相提取、吹扫捕集法等可同时实现样品浓缩。
常用的浓缩方法有减压旋转蒸发法、K-D浓缩法、微型柱浓缩和氮气吹干法等，可结合实际需要选择使用。K-D浓缩法、微型柱浓缩法比较适用于香气香味成分提取溶剂的浓缩。虽然对极易挥发的组分仍有损失，但相对其它浓缩方法而讲，低沸点组分的损失最小。旋转蒸发器可以在较低温度下使大体积（50~500 mL）提取液得到快速浓缩，操作方便，但容易损失，特别对于沸点低的组分。氮气吹干法是直接利用氮气流轻缓吹拂提取液，加速溶剂的蒸发速度来浓缩样品，只适合于小体积浓缩，且对于蒸汽压较高的组分比较容易损失。重现性不如K-D浓缩法、微型柱浓缩好。
3.14 衍生化方法
对难挥发，热稳定差，极性太强的物质可以用衍生化方法来处理，以降低蒸汽压，增加稳定性，然后进行GC/MS分析。例如有机酸可甲酯化后进行GC/MS分析（安捷伦资料）。
