辞旧迎新 英文:EAAL方法预防肝癌复发转移的研究

发表时间：2011-03-27 发表者：毛一雷 (访问人次：62)
研究摘要：
肝癌手术后复发转移的控制，是肝癌治疗面临的最主要挑战。细胞免疫治疗方法EAAL在大规模随机临床试验中被证明可以降低肝癌术后复发率18%，使复发的危险率减少41％。在本研究中，我们将采用不同的治疗方案，对EAAL配合手术、介入化疗和局部栓塞等常规肝癌治疗方法对复发和转移及病人生存期的影响进行系统的临床研究。在此基础上，我们将进一步研究EAAL方法作用的可能机制，及肝癌特异性淋巴细胞的治疗可行性。
名词缩写：
EAAL: expanded activated autologous lymphocytes, 扩增活化的自体淋巴细胞
CIK Cells: cytokine induced killer cells, 细胞因子诱导的杀伤细胞
TIL: tumor infiltrating lymphocytes, 肿瘤浸润淋巴细胞
研究目的：
1.      在大规模随机临床试验的基础上，试验EAAL方法作为免疫辅助治疗，对手术和其它常规治疗后病人复发和转移的抑制作用；
2.      通过设计不同的EAAL使用疗程和使用频率，试验该方法延长病人生存期的效果；
3.      在上述基础上，研究EAAL方法可能的作用机制；
4.      通过引入肿瘤特异性淋巴细胞的方法，研究更有效的肝癌细胞免疫治疗方法。
研究背景：
大多数肝细胞肝癌，特别是伴发肝硬化和其它一些症状的情况下，预后往往都很差。外科手术，包括肿瘤切除术或是肝移植，往往是肝癌治疗的唯一手段。化疗和肿瘤栓塞术只能缓解症状，对存活率和存活时间没有显著改善[1]。因此，寻找肝癌手术后预防转移和复发的手段，成为肝癌治疗的重要研究方向。
尽管大多数肝癌病人的预后不好，但越来越多的证据表明，免疫应答至少在部分肝癌病人中，对疾病的进展乃至病人的存活至关重要。
1.       T淋巴细胞:
（1）       CD8+ T细胞对肝癌细胞具有特异性识别杀伤作用：
较早的研究表明，与大量无T淋巴细胞的样本相比，有T淋巴细胞浸润的小肝癌的复发率低、5年生存率高。而且占优势的浸润淋巴细胞为CD8+的T淋巴细胞，而非CD4+的T淋巴细胞[2]。随后，在肝癌组织中发现了特异性识别多种肿瘤相关抗原[3]、肿瘤特异性共享抗原[4]、自体抗原（AFP[5]和SART-1[6]）、病毒表位[7，8]的T细胞。CD8+ T细胞的浸润与肝癌细胞的凋亡呈正相关[Eur J Surg Oncol. 2004 Feb;30(1):53-7. CD8+ lymphocyte infiltration and apoptosis in hepatocellular carcinoma.Ikeguchi M, Oi K, Hirooka Y, Kaibara N.]我们自己的工作证明，肝癌组织浸润的CD8+ T细胞，在体外经过活化后，具有杀伤自身肝癌细胞的功能（未发表数据）。
（2）       CD8+ T细胞可特异性识别杀伤具有干细胞特征的肿瘤细胞
肿瘤干细胞被发现普遍存在于包括肝癌[  ]在内的多种恶性肿瘤组织中，并被认为是肿瘤常规治疗后复发和转移的直接原因[Cancer Cell Int. 2007; 7: 9. Role of stem cells in cancer therapy and cancer stem cells: a review Jayesh Sagar,  Boussad Chaib, Kevin Sales, Marc Winslet, and Alexander Seifalian]。而另一方面，肿瘤干细胞同样表达肿瘤特异性抗原，并可作为免疫治疗的靶点，如前列腺癌细胞表达的前列腺干细胞抗原PSCA[ ]。最新的研究表明，多发性骨髓瘤（MM）的癌前病变MGUS常常表达胚胎干细胞参与自我更新的关键分子SOX2。而识别该分子特异性T细胞的存在提示癌前病变的良好预后。我们最近建立的一株干细胞样肝癌细胞系中，发现该株细胞表达大量肿瘤特异性共享抗原，同时可被来源于同一病人自身的CD8+ T细胞特异性杀伤。这提示我们通过利用免疫治疗杀伤肿瘤干细胞，可能达到控制肿瘤复发和转移的目的。
（3）       辅助性CD4+ T细胞对移植后肝癌的复发有抑制作用
有文献表明，肝癌患者进行肝移植后，肝癌复发的危险率与CD4：CD8的比例呈正相关，但此种CD4+ T细胞为辅助性T细胞，而不是表达CD25分子的调节性T细胞（regulatory T cells）[9]。
（4）       CD4+CD25+调节性T细胞可通过抑制CD8+ T细胞的作用促进肝癌细胞生长
存在于肿瘤边缘位置及肿瘤浸润性调节性CD4+CD25+T细胞具有抑制肿瘤特异性CD8+ T细胞增殖和活化的作用，成为肝癌细胞不受控制生长的原因之一[9，Hepatology. 2005 Apr;41(4):722-30. Compromised lymphocytes infiltrate hepatocellular carcinoma: the role of T-regulatory cells.Unitt E, Rushbrook SM, Marshall A, Davies S, Gibbs P, Morris LS, Coleman N, Alexander GJ.]。此外，在肝癌病人的外周血中，其CD4+CD25+调节性T细胞也明显增加，并于肿瘤局部CD4+CD25+调节性T细胞的浸润呈正相关。这些调节性T细胞在体外与非调节性T细胞共同培养时，抑制后者的增殖和细胞因子的分泌[Cancer Res. 2005 Mar 15;65(6):2457-64.Increased populations of regulatory T cells in peripheral blood of patients with hepatocellular carcinoma.Ormandy LA, Hillemann T, Wedemeyer H, Manns MP, Greten TF, Korangy F.]。
2.       细胞因子：
细胞因子是调节机体天然免疫和获得性免疫的关键因子。细胞因子环境的平衡对获得保护性免疫（如抗病毒，抗肿瘤，抗细菌免疫）及避免病理性免疫（如自身免疫病）至关重要。一般来讲，Th1 类细胞因子有利于抗肿瘤免疫，而Th2类细胞因子可能有抑制肿瘤免疫的作用。Budhu A等人最近报道，肝癌的局部转移与局部组织的细胞因子为环境直接相关。相比于不利于肝内静脉转移的微环境（MAM），趋于肝内静脉转移的微环境中的细胞因子标签出人意料地高表达Th2类细胞因子IL-4, IL-5, IL-8和IL-10，而明显低表达Th1类细胞因子，包括IL-1A, IL-1B, IL-2, IFN-g和 TNF。在利用细胞因子进行的肿瘤治疗试验中，有证据表明，在作为细胞因子配合疫苗使用时，Th1类细胞因子，包括IL-2，-7，-12，-18，IFN-g，TNF-a及部分Th2 类细胞因子，包括IL-4，-6，可诱导抗肿瘤抗原特异性的免疫应答。在直接使用细胞因子进行恶性肿瘤的治疗中，IL-2 和IFN-a，-g应用得最为广泛。而在评价抗肿瘤免疫中，T细胞在识别肿瘤细胞后分泌IFN-g的量成为评价抗肿瘤免疫应答的最重要指标之一。
针对肝癌免疫应答的上述特性，适当的免疫治疗方法有可能通过杀伤肿瘤细胞，包括肿瘤干细胞的方式，达到控制肝癌复发和转移的目的。这需要解决两方面的问题（1）有识别肝癌细胞的特异性杀伤性T细胞；（2）能够改善患者体内免疫环境和免疫微环境，使控制和杀伤肿瘤细胞的免疫细胞能够发挥功能。这包括降低CD4+CD25+调节性T细胞的数量，并使Th1/Th2细胞因子水平向Th1平衡。为此，我们拟采用细胞过继免疫治疗---扩增活化的自体淋巴细胞（Expanded Autologou Activated Lymphocytes，EAAL)的方法，探索免疫治疗对肝癌复发和转移的预防性效果和对病人生存率、生存期的影响。
肿瘤免疫治疗的主要手段之一，细胞过继免疫治疗，是通过离体扩增病人自身特异性或非特异性淋巴细胞、扩增并回输的过程，来满足上述条件，达到杀伤和/或控制肿瘤细胞的目的。这种方法建立于T细胞活化分子白细胞介素2 (IL-2)的发现，包括肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor Infiltrating Lymphocytes，TIL）方法，LAK（Lymphokine-induced Killer）细胞、CIK （Cytokine-induced Killer）细胞和EAAL。这些方法最主要的不同在于培养前所使用的细胞、培养后所获得的细胞种类不同、培养效率和临床效果不同（表1）。
表1. 不同细胞过继免疫治疗方法的比较
细胞免疫治疗名称
TIL
LAK
CIK
EAAL
起始细胞类型/数量
肿瘤浸润淋巴细胞
PBMC，3000-5000ML*
PBMC，3000-5000ML*
PBMC，20-100ML
产出细胞主要类型
CD8+ T细胞
NK细胞
CD3+CD56+ T细胞（〉50%）
CD8+ T细胞：63.0±24.6%
CD4+CD25+ 调节性T细胞
无相关报道
无相关报道
无相关文字报道，口头报告数据：20-50%
1.7±1.1%
扩增倍数
无相关报道
无相关报道
1-10倍
100-1000倍以上
产出细胞特异性
肿瘤特异
非特异
非特异
ND
临床试验有效性
晚期恶性黑色素瘤消退肿瘤作用可达70%[ ]
血液肿瘤
血液肿瘤
降低41% 肝癌术后复发危险率[ ]
副作用
白化病（自身免疫病）
无相关报道
无相关报道
主要为自限性低热，未见II级以上副作用
PBMC：外周血单个核细胞
ND：未检测
*使用单个核细胞采集机分离病人相当于此体积的PBMC。
二十世纪八十年代，Steven Rosenberg等开始在体内或体外利用IL-2刺激机体的T淋巴细胞，治疗转移的恶性黑色素瘤（恶黑）和肾癌。在早期的研究中，大剂量IL-2直接给予病人。在对567名恶黑患者的临床试验研究中，21％的病人有临床效果12。然而，大剂量IL-2的治疗同时带来了严重的副作用，包括肾衰、严重的口炎和全身反应等。2002年，Rosenberg等报道了一种新的细胞过继回输方法，进行肿瘤的免疫治疗13。他们在体外筛选出具有病人自身恶黑细胞特异性杀伤作用的肿瘤浸润淋巴细胞（TILs），大量扩增后回输给自体病人。在这种方法中，经过体外IL-2和抗CD3抗体的联合作用，数量高达1011的、肿瘤细胞高度特异的TILs被回输至病人体内，这些细胞以CD3+CD8+CD56-的T细胞的为主。在接受治疗的13例病人中，6例病人完全缓解，4例病人部分缓解。这10例病人均发生明显的肿瘤缩小和/或消失。这个报道，重新燃起了免疫学家和临床医生对细胞过继治疗肿瘤的热情。然而，TIL过继回输的方法在很大程度上受到肿瘤细胞原代培养的成功率、肿瘤特异性浸润细胞的可获得性、体外扩增能力、体外培养后功能的可维持性的限制。因此，这个方法长期以来难以在临床实施推广。
最近，在传统的抗CD3抗体和IL-2体外扩增活化淋巴细胞（细胞因子诱导的杀伤细胞，CIK细胞）方法的基础上，日本国立癌症研究院关根晖彬（Teruaki Sekine）博士开发了一种新的肿瘤免疫治疗的方法---扩增活化的自体淋巴细胞（Expanded Autologou Activated Lymphocytes，EAAL)。在这种新的方法中，使用的淋巴细胞来源于病人自身的少量外周血（20-100ml）。在约2周的短时间内，这些淋巴细胞可以活化扩增达1000倍后，再回输于病人体内。在一项历经约10年的大规模随机临床试验中，经过EAAL治疗的肝癌术后患者，与不经该治疗的对照组相比，肝癌术后复发率降低18%，复发的危险率减少了41％[ ]。此外，初步的数据显示，该方法对于恶性脑肿瘤具有一定的预防复发和转移、延长病人生存期的效果[ ]。
机体内的T淋巴细胞包括许多针对不同抗原的特异性细胞。其中一部分细胞经过培养后，会针对不同的肿瘤抗原/病毒抗原具有广泛的识别和杀伤效果。我们的初步研究结果显示，EAAL具有以下特点，使之成为具有抑制肿瘤复发转移的可行性治疗方法。
1．   EAAL的主要细胞类型为杀伤性淋巴细胞：
在体外扩增激活后的EAAL细胞，其主要成分（表2）包括（1）CD3＋CD56＋（约10％）细胞，它们既具有自然杀伤细胞特征、又具有T淋巴细胞特征的细胞群体；（2）CD8+的杀伤性T淋巴细胞（约50 - 70％）；（3）NK细胞（约10%）。CD3+CD56+细胞中的一部分可识别在部分肿瘤细胞中改变的糖类抗原；CD8+ T淋巴细胞为机体最主要的抗肿瘤淋巴细胞群体，其中可有识别多种不同肿瘤抗原/病毒抗原的特异性杀伤性T细胞，对肿瘤细胞或病毒进行杀伤；NK细胞对HLA表达下调的肿瘤细胞有直接的杀伤作用。
表2. EAAL细胞培养前后细胞类型的变化
细胞表面分子
培养前的百分比
（均值）
培养后的百分比
（均值）
CD3+CD4+
33.2
10.6
CD3+CD8+
22.8
63.0
CD3+CD56+
5.4
11.7
CD3-CD16+
12.6
11.8
CD4+CD25+
3.3
1.7
2．  EAAL中CD4+CD25+ 抑制性T细胞的百分率低于外周血水平：
经过EAAL方法扩增活化的自体淋巴细胞，回输的细胞中CD4+CD25+ 抑制性T细胞的百分率仅约1.7±1.6%。因此，细胞回输后不会增加免疫抑制性淋巴细胞，有利于细胞毒性淋巴细胞发挥其抗肿瘤作用及分泌Th1类细胞因子。
3．  EAAL分泌的细胞因子以Th1类细胞因子为主：
经过培养的EAAL细胞，在经过活化后，其分泌的细胞因子主要为Th1类细胞因子，尤其是对肿瘤、病毒等具有杀伤功能的细胞因子IFN-γ和TNF-a（图1）。这些细胞因子将有利于淋巴细胞对肿瘤细胞的直接杀伤以及机体免疫环境克服由肿瘤引起的免疫抑制。
4．  回输EAAL后机体免疫细胞和免疫环境的变化趋向于Th1
1) 提高肿瘤患者体内抗肿瘤细胞因子γ干扰素 (IFN-γ) 的水平。
在使用EAAL方法治疗的肿瘤患者体内，回输后，其分泌抗肿瘤细胞因子IFN-γ的淋巴细胞数目明显增多 (图2，左)。同时，分泌IFN-γ的量明显上升 (图2，右)。
IFN-γ除本身具有抑制和杀伤肿瘤的作用外，对机体免疫系统还具有重要的调节作用。它可使免疫系统的功能趋向于Th1方面平衡，即发挥杀伤性功能。而肿瘤病人体内由于肿瘤分泌的免疫抑制因子的作用，机体免疫环境多为免疫杀伤抑制性环境，阻碍了杀伤性淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤。因此，EAAL在抗肿瘤治疗的作用机制除直接杀伤或抑制肿瘤生长外，可能还包括改善患者体内的免疫抑制性环境，优化肿瘤杀伤的免疫环境 (见下文2))。
2) 调节肿瘤患者免疫系统，明显提高具有抗肿瘤作用的淋巴细胞在免疫系统中的比例。
EAAL回输后，病人外周血淋巴细胞中CD8+ T细胞的比例明显上升 (图3)，CD4+ T细胞与CD8+ T细胞的比例明显下降 (图4)。说明病人的免疫系统趋向于向免疫杀伤功能的淋巴细胞平衡。
EAAL自体回输治疗，在日本已经进行了上万例病人的治疗。其主要副作用为自限性低热（47%，约37.5°C）。其它所观察到的副作用均为1或2级并且具有自限性，未有患者出现肺或肾部的症状、任何迹象的感染、肝功能衰退或自身免疫失调反应。
利用EAAL免疫细胞治疗肿瘤的方法与手术，放化疗相比，虽然在临床上可见其缩小肿瘤结节的效果，但对大的肿瘤杀伤效果不如其它治疗方法。而在另一方面，免疫治疗对预防癌症复发、控制肿瘤生长的效果和对患者生存质量（QOL，quality of life）改善效果比较好。不仅如此，在与放化疗配合使用时，免疫治疗与放化疗具有协同作用。因此，免疫治疗方法较好的适应症，应当是用于手术后和/或配合常规放化疗，达到预防肿瘤复发、转移，提高患者生活质量的目的。
国内目前很多医院采用传统的CIK细胞进行实体瘤的免疫治疗。在使用过程中我们发现，传统CIK细胞培养方法存在以下不足：
（1）       缺乏大规模随机临床试验对实体瘤治疗效果的评价。
（2）       对病人免疫系统损伤较大、导致病人对放化疗耐受性差：
传统的CIK细胞培养，需要经过淋巴细胞分离仪，获取3000－5000ml病人外周血量的淋巴细胞，相当于病人全身循环血中的淋巴细胞。经过这样的淋巴细胞采集过程，病人体内的淋巴细胞计数大幅度降低，免疫力较差，对放化疗的耐受差，身体状况受到较大影响。在CIK细胞与放化疗联合治疗时，效果不好。
（3）       培养效率低：
传统的CIK细胞培养，体外活化后，细胞的扩增效率一般为5倍左右。扩增效率的低下，是起始细胞数要求多的一个重要原因。因此，提高细胞活化扩增的效率，是传统CIK细胞培养方法需要改进的一个重要方面。
（4）       培养后的细胞含大量CD4+CD25+免疫抑制性T细胞群体，在体内、体外可抑制抗肿瘤免疫应答。
传统CIK细胞培养方法，在获得大量CD3+CD56+的CIK细胞同时，还有约30％左右的CD4+CD25+ T细胞。这种细胞群体被称为调节性T细胞，其在体内体外的功能是抑制淋巴细胞的增殖、活化。这群细胞的比例增大，不利于具有抗肿瘤免疫功能的其它淋巴细胞群体的增殖及功能的发挥。因此，降低细胞培养体系中这群抑制性T细胞的比例，将有效提高具有正常杀伤免疫功能的T细胞的活化、增殖及其功能。
（5）       细胞稳定性较差
细胞收获1－2小时内不能马上回输，细胞就会死亡。
（6）       由于细胞采集的原因，不能进行高频治疗
（7）       付出淋巴细胞分离的额外费用（3800元/次）
（8）       整个细胞培养过程步骤繁琐、人为因素多、可控性差、重复性差、不适合规模化生产
而我们选择EAAL疗法作为我们临床试验选择的肿瘤免疫治疗方法，关键基于这种改进的方法相比较于传统的CIK细胞培养方法具有革命性的优势：
（1）       治疗的安全性：
该疗法在日本已经完成了超过2000例病人的临床治疗。副作用以自限性低热（37－38°C）为主，所观察到的副作用均为1或2级并且具有自限性，未有患者出现肺或肾部的症状、任何迹象的感染、肝功能衰退或自身免疫失调反应。
（2）       治疗的有效性：
根据The Lancet（柳叶刀，2000: 356（9232）：802-807）的报道，在日本进行的肝癌手术后大规模随机临床试验中，使用EAAL进行的免疫治疗可提高患者的无复发存活率：与对照组相比，免疫治疗组出现首次复发的时间要明显延长（p=0.008）。与无该治疗的病人相比，EAAL治疗组肝癌术后复发率降低18%，复发的危险率减少了41％（p=0.01）。
（3）       细胞扩增的高效性和高活性：
EAAL方法的细胞的扩增效率约为200-1000倍，保证少量外周血即可达到所需细胞数目。其培养后活率在95％以上，12小时内细胞活率没有降低，24小时内细胞活率降低约5％，细胞质量稳定，细胞制剂可长途运输。
（4）       细胞产品质量的可控性和细胞产品规范生产的可操作性
本试验所采用的细胞培养试剂为批量生产的EAAL培养试剂系统，包括从基本培养基的配置、抗体和细胞因子的添加，均采用了严格的标准化试剂和细胞培养用一次性耗材的供应、质量控制、批次一致性等的质量保证系统。同时建立了细胞培养的标准化操作流程。在此标准化系统下进行的细胞培养，细胞的扩增效率约为200-1000倍，活率在90％以上，12小时内细胞活率没有降低，24小时内细胞活率降低约5％，细胞类型主要以CD8+ T细胞为主（50-70％），CD3+CD56+ T细胞约为20-30%, 系统操作过程中实行严格的系统无菌控制，细胞培养体系为密闭体系，保证细胞产品无细菌、霉菌、支原体、病毒等任何微生物和内毒素的污染，使细胞产品有质量可控性。而系统的使用中无需人工添加任何试剂，将人为干扰因素和不确定因素降至最低，使细胞产品具有规范生产的可操作性。
肿瘤的免疫治疗基础，是机体的免疫系统具有监视和杀伤肿瘤细胞的能力。在临床上，肿瘤的自发性消退虽不常见，但的确存在。相比较于化疗和放射治疗，肿瘤免疫治疗具有特异性高，副作用小的特点。理论上来说，每一位肿瘤病人都可从免疫治疗中获得益处，并且早期病人由于机体免疫系统尚未受到肿瘤的严重影响，对免疫治疗的应答较好，疗效相对也会加强。而目前免疫治疗的对象往往是晚期无法进行其它治疗的病人。即使在这些病人群体中，免疫治疗所显现的疗效，已足以使其成为继手术、放化疗之后的第四种肿瘤治疗手段。