超级好丈夫的标准:鱼类口服免疫的研究进展

 李新华,沈锦玉,潘晓艺,郝贵杰( 浙江省淡水水产研究所,浙江　湖州　313001) )     关键词:口服免疫;免疫机制;疫苗包裹;疾病预防 1942 年,加拿大学者Duff用口服疫苗预防硬头鳟(Salmo gairdneri)的疖疮病获得成功,开创了鱼类免疫的先河。至今,鱼类免疫主要包括注射、浸泡、口服等,前两种免疫方法已得到广泛应用,但胃酸及消化酶等破坏抗原,鱼类口服免疫效果不理想。目前,由于包裹技术的进一步发展,新的包裹材料不断开发,鱼类口服抗原经包裹之后,能更有效地抵挡胃酸及各种消化酶的破坏,抗原物质缓慢而持久地释放,使得免疫保护的时间和效果大幅提高。笔者从鱼类口服免疫的机制及影响因素和提高口服免疫效果的几种方式等方面综述了鱼类口服免疫的研究进展。 1 　口服免疫的机制 关于口服疫苗的免疫机制,川合研儿等曾作过如下的推测:疫苗经过肠壁而进入鱼体内,刺激鱼体产生相应的抗体,这些抗体的一部分通过粘液分布到体表。当鱼体再次接触到该类病原时,即同粘液中的抗体结合而失去感染力,消化管和体表获得局部免疫。高等脊椎动物的抗原经口服进入消化道之后,先到达肠相关淋巴组织(GALT),结合呼吸道黏膜和泌尿生殖道黏膜等形成一道黏膜免疫网,成为阻止病原入侵的第一道屏障。然后,肠黏膜中丰富的抗原提呈细胞(M细胞)将抗原俘获运输到巨嗜细胞和淋巴结,刺激B细胞产生特异性免疫反应,产生IgA中和侵入机体的病原体。黏膜免疫在高等脊椎动物研究较多,肠黏膜摄取病原体,诱导产生T细胞和B细胞,然后由诱导位点IgA产生分泌型免疫球蛋白(S-IgA),S-IgA协同一些免疫活性细胞CD4+,CD8+等对入侵病原体进行吞噬、阻抑粘附、溶解、中和等清除。但鱼类相关的研究比较少,Stlouis-Cormier提出鱼类存在S-IgA的假说,认为皮肤和胆汁中的免疫球蛋白有较大的区别。他们用间接荧光抗体技术在虹鳟(Oncorhynchus mykiss) 黏膜浆细胞中发现S-IgA。有学者认为鱼类与高等脊椎动物黏膜免疫相类似,但需要证实。Companjen等研究证实,鱼类后肠为抗原吸收和加工的主要部位。抗原可被后肠的巨噬细胞摄取,能诱导宿主产生免疫应答。Grove S等揭示了大西洋比目鱼( Hippoglossus hippoglossus)的后肠、鳃等组织含有IgM细胞。鱼类的口服免疫转运机制目前尚不很清楚。一般认为鱼类缺乏象高等脊椎动物肠道内的抗原提呈细胞M细胞,所以口服抗原在肠道蠕动作用下,小分子及可溶性物质可经肠黏膜细胞间的空隙渗透进入血液;大分子颗粒则由巨嗜细胞吞噬后,在细胞内加工,提呈到达相关的淋巴组织,也可经细胞间转运,运输到循环系统,经血液或淋巴液转运至淋巴结产生免疫反应。鱼类口服免疫同样既能产生全身免疫,也能产生局部的黏膜免疫。真骨鱼类的后肠在免疫中起很重要作用,巨嗜细胞、淋巴细胞和嗜酸性颗粒细胞在后肠内层黏膜均有发现。且已在鲤鱼(Cyprinus carpio)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、金鱼( Carassius auratus)等多种鱼类的免疫作用已得到证实。罗晓春等对斜带石斑鱼( Epinephelus coioides)皮肤、眼角膜、鳃、前肠及后肠等相关免疫组织结构进行了研究。结果表明黏膜组织中存在杯状细胞、淋巴细胞、巨嗜细胞等免疫相关细胞,具有完成免疫应答的细胞基础。此外,在黏膜层还有与哺乳动物肠相关淋巴组织(GAL T)相类似的相关淋巴促进细胞。因此真骨鱼类虽然不拥有肠相关淋巴组织,但其肠黏膜内层的独特功能同样能够通过肠黏膜内的巨嗜细胞和颗粒细胞传递和表达免疫反应。研究者也已经证实,真骨鱼类黏膜巨嗜细胞在诱导免疫方面的必要性。真骨类鱼肠黏膜中嗜酸性颗粒细胞(EGC)在黏膜免疫中起重要作用,这种细胞类似于哺乳动物的伪足细胞,但不释放组胺而且有自己的结构特性。EGC细胞生成于发育早期,平时游走于身体各部,当进食或者有异己蛋白入侵时集中到肠黏膜处对异物进行吞噬。Picchietti等用灭活的食果糖乳杆菌(Lactobacillus fructivorans )以口服免疫的方式接种黑鲷(Sparus auratus),除了肠道Ig阳性淋巴细胞数量提高外,嗜酸性细胞数量也显著提高。龚晖等用免疫刺激复合物(Immuno stimulating complexes,ISCOMs)以浸浴和口服的方式免疫欧洲鳗鲡(Anguilla anguilla),免疫鳗T淋巴细胞(Thymus-derived lymphocyte cell, T-cell) 增殖转化能力显著提高。以上结果提示经黏膜免疫接种疫苗,不仅诱导产生抗体介导的免疫应答,而且能够诱导包括细胞免疫在内的其他类型的免疫应答,提示细胞介导的免疫应答在免疫保护方面发挥着重要作用。 2 　影响鱼类口服免疫效果的因素 鱼类口服免疫的第一道障碍来自于消化道酶的破坏。胃蛋白酶在胃壁细胞分泌的盐酸作用下迅速激活并对抗原蛋白进行酶解;水解酶也在酸的作用下将蛋白质进行更进一步的水解为胨,破坏抗原的完整性,部分或全部失去抗原的免疫原性。经蠕动胃内容物排空进入肠道,胰液内的肽链内切酶将蛋白质分解为多肽、小肽和少量的氨基酸。肽类再由胰液和肠液的羧肽酶、氨肽酶、三肽酶等水解为氨基酸;脂质则由胰液中的脂酶和胆汁共同作用分解为2-单酸甘油酯和甘油。有试验证明, 用HGG作为免疫抗原免疫虹鳟,之后定期收集胃、幽门垂、肠的黏膜内容物和血液。结果发现,胃和幽门垂处超过90%的HGG片段分子量超过140kDa(完整的HGG分子为150kDa),而到了前肠37%的HGG片段分子量约45.60kDa,小分子肽类和氨基酸在前肠被吸收,后肠大分子片段比例相对增加,超过140kDa的片段约占35%。血清中的大分子片段约为12%,有部分HGG片段大于200kDa,推测可能是因为HGG与其他分子相结合所致。口服免疫的第二道障碍是肠黏膜的上皮细胞。高等脊椎动物有90%的小肽在肠道纹状缘被降解。和哺乳动物的小肠上皮一样,真骨鱼类的上皮细胞和纹状缘也含有碱性磷酸酶(A KP)。该酶与肠上皮的消化吸收有关。哺乳动物只有在哺乳期后肠的胞饮才吸收完整的蛋白, 而鲇鱼(Clarias lazera)、鲈鱼( Perca fluviatilis)、虹鳟和鲤鱼等多种鱼类均有发生,且不分发育阶段,从幼体至成熟,后肠细胞的胞饮都一直存在,最初认为无胃鱼类均有小肠上皮细胞的胞饮作用,后来证实了有胃鱼类也如此。标记发现,HRP在肠黏膜内壁细胞内降解为次级结构或者小肽,但是加大剂量能在血液中检到完整的HRP,这就意味着有很大一部分蛋白质抗原在被上皮细胞吞噬之后在细胞内被降解,这也是鱼类需要较高饲料蛋白的原因之一,因此要克服上皮细胞的胞饮对蛋白质的降解, 必须加大抗原蛋白的口服剂量。 3 　提高口服免疫效果的措施 3. 1 　包裹胃酸的作用和蛋白酶的水解使抗原到达吸收部位后完整性和免疫部位已经被破坏。为了保护抗原的完整性使其顺利到达吸收区域,可采用包裹抗原的方式,做成微囊颗粒,抵御消化道的消化作用。可用的包裹材料有肠衣、淀粉、明胶、藻酸盐和聚合材料PLG、PLEA等。包裹的材料必须符合3个条件: ①能够自然降解; ②无毒,对鱼体无任何负作用; ③不影响抗原的免疫原性,材料便宜,简单易得。常用的几种包裹方式有:(1) 海藻酸钠　海藻酸钠系多糖类化合物,常用稀碱从褐藻中提取而得。可溶于不同温度的水、乙醇、乙醚及其他有机溶剂;不同分子量产品的粘度有差异。海藻酸钠稳定、无毒、成膜性或成球性较好,是最常用的囊材与载体材料。2%的海藻酸钠水溶液用磁力搅拌溶胀过夜后,加入6%的PVPK30混匀,然后加入10¹²cfu/ml的菌悬液,搅拌均匀。以1 ml/min的速度进料,用自动喷干仪喷雾干燥,喷干仪进风口温度为120～130℃,出风口为65～75℃,干燥得到1～3μm的微囊颗粒,以10¹⁰cfu/kg拌料投喂。Joosten等用海藻酸钠包裹溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)同时免疫有胃鱼虹鳟和无胃的鲤鱼,3周后取血和肠黏膜ELISPOT法检验发现,抗体效价远比对照组未包裹抗原免疫的要高,同时取黏膜和鳃切片特异性染色,结果浆细胞大量增加。李新华等用海藻酸钠包裹嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila) 疫苗口服免疫银鲫( Carassius auratus gibelio),结果发现,微胶囊疫苗组鱼血清抗体效价较高,峰值为1∶80,且维持时间较长;各肠段的黏膜抗体中,后肠黏膜抗体效价最高,微胶囊疫苗组峰值达1∶320,前肠的肠黏膜抗体效价也有一定的水平为1∶40;肠道免疫组化试验也得到相似结果:在不同时间对前、中、后肠切片进行免疫组化染色,从光镜下观察到肠黏膜外层和黏膜下层均有阳性着色,以包裹全菌苗为最多,未包裹菌苗较少。由此得出结论:口服海藻酸钠包裹后的抗原不仅能激发鱼体全身免疫,还能诱发局部黏膜免疫,口服免疫将是一种行之有效的免疫方法。(2) 聚交酯醣酯聚合物(Polylactide-co-glycolide, PLG) 目前,用得最为广泛的是聚交酯醣酯聚合物类。它安全、降解性好(活体中2～3个月降解)。PL G必须先用有机溶剂溶解。乙酸乙酯(EA)毒性小,口味好,但对PLG的溶解性和沸点不如二氯甲烷(DCM)。PLG的包裹过程包括PLG的溶解,乳剂的形成,乳剂的稳定,有机溶剂的清除以及颗粒性状的检验:先将PLG溶解在有机溶剂(DCM)内与抗原的水溶液相混合,搅拌形成油包水的乳剂,然后加稳定剂聚乙烯醇(PVA)之后通过蒸发(一般采用真空旋转蒸发仪清除残留的有机溶剂)或者萃取将有机溶剂分离,干燥成1～10μm的抗原微粒, PLG的操作流程见图1,定量检查包裹效果和显微观察微粒性状见图2 。然后拌入饲料投喂。图1 　PL G包裹疫苗的操作流程图2 　扫描电镜下的PL G包裹颗粒(3) 脂质体　磷脂分散在水中自然形成多层囊泡,每层均为脂质的双分子层;囊泡中央和各层之间被水相隔开,双分子层厚度约为4nm。这种具有类似生物膜结构的双分子小囊称为脂质体。脂质体是纳米级材料,使用时先用氯仿溶解,真空旋转蒸发干燥后与菌悬液混合,搅拌形成乳剂,喷雾干燥即得抗原微囊颗粒,与饲料拌匀即可。脂质体包裹的疫苗不仅可以延缓被消化酶破坏降解的时间,同时也是一种很好的疫苗佐剂,能增强口服疫苗的免疫原性,刺激机体产生细胞免疫和体液免疫。此外,用来包裹的材料还有肠衣、明胶和淀粉等等。但是, Park等用肠衣包裹创伤弧菌(V. vulnificus)制成弧菌微囊疫苗免疫牙鲆(Paralichthys olivaceus),发现免疫效果反不如不包裹直接口服,原因是肠衣的保护影响了抗原的释放。因此不同的抗原应采取不同的包裹材料和包裹方式。同时, 要不断开发新的包裹材料, 如PLEA和PLEG等。张小江等采用可生物降解的合成高分子聚DL-乳酸-聚乙二醇共聚物(DL-polylactide-co-polyet hylene glycol, PELA),包裹哈维氏弧菌(V. harveyi)重组外膜蛋白Omp K后,制备成PELA-Omp K微球。斜带石斑鱼口灌四甲基异硫氰酸罗达明(TRITC)荧光素标记的Omp K-PELA微球后,第1d在其后肠观察到大量红色荧光微球,第3d荧光微球数量明显减少,第7d荧光微球基本消失。免疫组化研究结果表明,口服PELA-Omp K组在斜带石斑鱼后肠组织黏膜层可见较强的棕黄色阳性着色。口服PELA-Omp K组血清抗体效价显著高于口服Omp K蛋白溶液组与对照组;口服PELA-Omp K组的粘液抗体效价显著高于口服Omp K蛋白组。 3. 2 　改善肠道环境胃壁细胞分泌的胃酸对胃蛋白酶的活性和蛋白质的水解起着至关重要的作用。胃酸的分泌使胃内pH稳定在3.38(虹鳟),而胃蛋白酶在pH为3～5时才具有活性,因此,Lavelle等用碳酸氢钠和甲氰咪胍与抗原一起拌于饲料投服,发现每尾虹鳟(约200g/尾) 添加30mg 1h后胃内pH升至7.24。不同时间取胃肠黏膜内容物和血液,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析发现,抗原分子的完整性明显增加,同样在添加了75mg/尾的甲氰咪胍1h之后,胃内pH升至6. 98,采取同样的方式收集分析胃肠黏膜内容物也发现抗原HGG的完整性和大分子片段比对照组有显著提高。有研究发现,用辣根过氧化酶(HRP)和大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)一起拌料口服, SBTI能增加HRP在黏膜中的水平。在已知的蛋白酶活性区域,SBTI也能为HRP提供持续的保护作用。添加Mega-9和人造洗涤剂均能使血液中的HRP含量提高一倍,改善胃肠环境。另外,添加了氢氧化铝或者霍乱B毒素也能提高一些鱼类对HGG的吸收,增强抗原抗体反应。 3. 3 　多种免疫方式相结合免疫接种的目的是为激活机体的免疫系统,活化淋巴细胞产生免疫作用,诱发免疫应答来抵御病原体的侵袭。采用一种方式往往不能达到预期效果,因此可采用多种方式相结合强化免疫刺激。采用先浸泡后口服的免疫方式,对鱼的类结症进行免疫预防,提高了口服免疫效果。弧菌疫苗浸泡后再口服免疫欧鳗,免疫之后收集血液、黏膜,测抗体效价、细菌存活率及氧化酶活性,并进行动物半数致死量试验,发现浸泡之后口服效果比单浸泡和口服好,而且抗体浓度高峰持续时间长。该试验还发现,冻干苗比超低温冷冻的疫苗效果好。另外,还可以采用多次免疫的方式,连续投喂和间隔投喂,持续时间根据需要而定。采用HRM菌苗口服免疫虹鳟,每周5d ,2周后,接着间隔每周投喂1次,攻毒时保护力达90%以上。用FSA菌苗口服免疫虹鳟,投菌苗60μg/(d·尾),连续25d ,能刺激鱼体产生较高的抗体效价。用溶藻弧菌菌苗口服免疫幼龄鲤鱼与黑鲷,10星期后注射免疫,从组化及抗体效价分析得出,58日龄幼鱼免疫效果较好。 4 　小结 鱼患病之后药物的治疗效果往往难如人意,因此鱼类免疫被越来越多的人所关注,尽管注射和浸泡都已经取得了成功,但由于操作所需的人力和物力,注射免疫一般只限于亲鱼,而浸泡也只适用于鱼苗放养阶段。相比之下,鱼类口服免疫操作较简单、方便,抗原需要量则远不如浸泡免疫,可大大地减轻对鱼类的刺激,减少劳动强度和成本,易于重复强化免疫,是一种较好的免疫方式。鱼类的口服免疫不仅能刺激机体产生全身免疫作用,同时也能诱导肠黏膜产生黏膜免疫。黏膜是病原体首先接触和聚居之地,因此黏膜免疫能在第一时间对侵入机体的病原体进行阻挡和排除。但由于鱼类的种类繁多,各种鱼的机体和消化道系统也各有差异,例如鲤科鱼类没有真正的胃,无胃酸产生,肠道环境接近中性,因此投喂口服疫苗可以不予考虑酸水解和胃酶对抗原的破坏作用,而鲑科鱼类如虹鳟,有胃,内环境呈酸性,必须选择更合理的抗原处理方式。此外,鱼类消化系统的结构和功能不同,口服免疫的效果也差异很大。如草鱼(Ctenopharyngoclon godoniclells)肠道结构特殊,吸收部位主要在前肠而对抗原破坏相对较弱,因此草鱼的口服免疫能取得较好的效果,而大多数鱼类吸收大分子抗原是在后肠,这就增加抗原在消化道内存留的时间,被水解的可能性增加,所以必须对抗原加以保护以便顺利到达吸收区域。研究也发现,鱼类发育早期,消化道功能还不够完善,各种消化酶的功能不健全,对抗原的破坏较小,抗原的完整性相对较好。鱼体的大小也是影响鱼类免疫的因素之一,幼体阶段诱发的免疫应答效果较好,因此在鱼类发育早期进行口服免疫能取得较好的效果。另外,鱼类口服免疫有效剂量,免疫时间也因鱼的种类而异,鱼类的免疫特性又错综复杂,口服免疫还有许多领域需要研究。