西游记的收获:建立中药“对照指纹图谱”可行性探讨

建立中药“对照指纹图谱”可行性探讨
传统中医药理论和实践对中药质量评价模式提出了新的要求，其核心是测定任何一种活性成分都不能说明中药内在的质量。因此，一种综合的中药质量多指标评价模式，中药指纹图谱应运而生。我国正在开展的中药指纹图谱的研究，并试图应用于中药注射剂质量的评价，就是中药多指标质量评价的具体应用。本文是在假定已经研制出最佳色谱条件的前提下，以人参所含人参皂苷类、黄芩所含黄酮类化学成分的HPLC色谱数据为研究对象，对建立中药“对照指纹图谱”的可行性及影响指纹图谱数学相似度的一些因素进行探讨，试图对中药指纹图谱进行数学相似度评价及数学相似度限值的确定提供参考。
1 中药“对照指纹图谱”的建立
评价中药质量的稳定性，除了进行中药所含化学成分的指纹图谱相似性的直观对比以外，还可以对化学成分数据所代表的指纹图谱进行数学上的相似度比较，这与统计学上多指标样本之间的相似度比较概念相同，一般使用相关系数法或夹角余弦法这2种数学模型来进行。由于中药化学成分与中医临床疗效之间仍然缺乏科学的关联，中药指纹图谱与疗效事实上不存在相关性。而现阶段我国正在开展的中药指纹图谱研究，希望指纹图谱除了起鉴别的定性作用以外，还具有判断中药质量是否稳定的定量作用。
1.1 建立中药“对照指纹图谱”的必要性及方法
要对中药样品的指纹图谱是否符合标准进行检验，标准中必须有中药指纹图谱的标准参照系，如：中药“标准提取物”或中药“标准指纹图谱”，否则如何进行样品与标准的相似性比较。由于提供中药“标准提取物”存在许多方法上的困难，主要是“标准提取物”的量值传递因天然产物的不稳定性而变得难以持续进行；人为选择一张与各样品相似性最大的那张指纹图谱作为“标准指纹图谱”，在理论上品种内各样品指纹图谱之间的整体相似性在将达到最大化，那张指纹图谱可以作为标准中的参照系，但因选择标准的不确定性而变得难以进行。是否可以用较多具代表性的样品各色谱峰的平均值作为“标准指纹图谱”的替代，相当于有代表性的样品等量混合后形成的样品指纹图谱，称为“对照指纹图谱”，用以进行样品指纹图谱与标准之间的相似度比较。
以相关系数及夹角余弦法对获得人参、黄芩的HPLC色谱数据为指标进行计算，结果人参样品之间的相关系数值在0.655～0.991之间，夹角余弦值在0.786～0.986之间，说明人参指纹图谱样品之间的数学相似度较低，较难指定1张作为“对照指纹图谱”。黄芩指纹图谱样品之间的相关系数和夹角余弦值大于0.96，说明黄芩指纹图谱样品之间的数学相似度较高，指定任何一张都会有一定的代表性。比较“平均值样品”与各样品的相似度值，可以判断“平均值样品”是否能作为“对照指纹图谱”，用于中药指纹图谱相似性评价的参照系。对人参、黄芩样品的各色谱峰数据求平均值后，各样品与“平均值样品”的相似度计算结果见表-1。
表-1 各样品与平均值样品的相关系数、夹角余弦值表
样品名称
相关系数
夹角余弦
样品名称
相关系数
夹角余弦
人参--1
0.915
0.954
黄芩--1
0.998
0.998
人参--2
0.927
0.959
黄芩--2
0.997
0.997
人参--3
0.947
0.973
黄芩--3
0.962
0.966
人参--4
0.954
0.977
黄芩--4
0.996
0.997
人参--5
0.944
0.968
黄芩--5
0.979
0.981
人参--6
0.910
0.956
黄芩--6
0.996
0.996
人参--7
0.978
0.989
黄芩--7
0.997
0.998
人参--8
0.957
0.979
黄芩--8
0.996
0.996
人参--9
0.861
0.933
黄芩--9
0.997
0.997
人参--10
0.910
0.948
黄芩--10
0.996
0.996
人参--11
0.923
0.947
黄芩--11
0.994
0.993
人参--12
0.976
0.983
黄芩--12
0.991
0.993
人参--13
0.963
0.968
黄芩--13
0.978
0.983
人参--14
0.898
0.916
黄芩--14
0.978
0.981
人参--15
0.932
0.959
黄芩--15
0.997
0.998
从表-1中可以看出，“平均值样品”与各样品的相似度值明显高于样品之间的相似度值。人参样品之间的相关系数住由约50%小于0.9，减少到与平均值样品之间仅有约10%小于0.9；黄芩全部大于0.962。人参、黄芩“平均值样品”与样品的夹角余弦值全部大于0.9。由于人参、黄芩的“平均值样品”与各样品之间的相似度值明显高于样品之间的值，说明“平均值样品”具有较高的代表性，可以作为“对照指纹图谱”用于样品指纹图谱的相似度评价。
1.2 中药指纹图谱数学上的相似与质量的关系
对中药指纹图谱以这2种数学模型进行相似度比较时，指纹图谱之间具有很高的相似度值并能不表示质量的相近。取人参、黄芩全部样品各色谱峰数据的最大值、平均值、最小值各作为1个模拟样品，如果收集的样品足够多且具有代表性，则中药样品各数据的变化范围都在最大值、最小值之间围绕平均值波动。人参、黄芩模拟样品之间的相关系数及夹角余弦值计算结果见表-2，人参模拟指纹图谱见图-1。
表-2  人参、黄芩相关系数、夹角余弦值
品
种
样品名称
相关系数
夹角余弦值
最大值
平均值
最小值
最大值
平均值
最小值
人
参
最大值
1
1
平均值
0.942
1
0.971
1
最小值
0.829
0.953
1
0.899
0.967
1
黄
芩
最大值
1
1
平均值
0.988
1
0.985
1
最小值
0.975
0.994
1
0.971
0.994
1
从表-2中可以得知，人参、黄芩模拟样品之间的相似度值都较高，说明指纹图谱在数学上具较高的相似度值仅表示图形的相似，这符合2种数学模型的特点及适用范围。尽管最大值、平均值、最小值指纹图谱之间具有较高的相似度值，但质量差异是显而易见的。
1.3代表性样品对制订“对照指纹图谱”的重要性
为了制定出的“对照指纹图谱”具有代表性，必须对品种内部是否存在较大化学成分变异进行考察。对不同产地人参样品32份、黄芩样品33份进行HPLC色谱分析，每个人参样品获得人参皂苷类色谱数据20个，黄芩获得黄酮类色谱数据13个。以这些色谱数据为指标对样品进行系统聚类分析，结果表明人参、黄芩品种内不存在明显的化学成分变异。
在中药品种内无明显化学成分变异的情况下，为了保证制定的“对照指纹图谱”与各样品之间具有最大的相似度值，应在聚类分析树状图中每个聚类较密集的小类中去掉一些样品，即去掉相似度值最大的小类中1个或数个样品的数据，保留的样品数据完全能代表全部样品的信息。这相当于去掉同产地或同一份样品分成数份进行指纹图谱研究的样品，保留这些复份样品数据将会使各色谱峰的平均值偏向一侧。对同品种具有数家企业生产的中药来说，制定“对照指纹图谱”的实验样品是否具有代表性是影响样品与“对照指纹图谱”相似度的重要因素。结果人参、黄芩各保留15份样品用于“对照指纹图谱”的制定。
2 影响样品与“对照指纹图谱”数学相似度的因素
制定了中药“对照指纹图谱”以后，在不同的实验室分析同一份样品，由于人为因素或客观原因，如：不同柱效的柱子、仪器最小域值的设定等对小色谱峰的积分产生较大的影响。因此，必须研究这些因素引起的误差对样品与“对照指纹图谱”相似度值的影响程度。如果把基线不分离的色谱数据进行人为合并，将不利于指纹图谱相似度的自动比对。
2.1 小色谱峰对指纹图谱数学相似度的影响
中药同一样品不同实验室得到的指纹图谱会有一定差异，特别是对小色谱峰。因此必须研究小色谱峰的变化对指纹图谱数学相似度的影响，以考察中药“对照指纹图谱”的代表性和可行性。
（1）在人参、黄芩的指纹图谱中去掉色谱峰总数25%的最小色谱峰数据，即同时减少样品与“平均值样品”中色谱峰数量的25%。结果人参减少5个，黄芩减少4个。对已经去掉25%色谱峰数据的各样品进行相关系数及夹角余弦法比较分析，结果见表-3中B项。从表-3中B项可以得知，在“平均值样品”与样品指纹图谱都去掉25%的色谱峰数据以后，相关系数法计算出的相似度值，人参由2个样品小于0.9增加到5个小于0.9，影响较大；黄芩的相关系数变化不大。人参、黄芩以夹角余弦法计算出相似度值的变化较小，说明相关系数法比夹角余弦法更能体现小色谱峰的差别。
表-3  色谱峰处理前后相似度值
方法
小峰处理方式
代号
人参
黄芩
相关系数
平均值与样品保留全部的色谱峰
A
2个<0.9
0个<0.9
平均值与样品都去掉25%的小峰
B
5个<0.9
0个<0.9
样品去掉25%的小峰，平均值为全部色谱峰
C
3个<0.9
0个<0.9
平均值去掉25%的小峰，样品为全部色谱峰
D
4个<0.9
0个<0.9
夹角余弦
平均值与样品保留全部的色谱峰
A
0个<0.9
0个<0.9
平均值与样品都去掉25%的小峰
B
0个<0.9
0个<0.9
样品去掉25%的小峰，平均值为全部色谱峰
C
0个<0.9
0个<0.9
平均值去掉25%的小峰，样品为全部色谱峰
D
0个<0.9
0个<0.9
（2） “平均值样品”的色谱峰数据不变，各样品人为减少25%小色谱峰的数据，评价样品在缺失一些小色谱峰数据的情况下，指纹图谱相似度的变化。结果见表-3中C项。从表-3中C项可以看出，以相关系数法计算，人参由2个样品小于0.9增加到3个小于0.9，仍然存在一些影响；以夹角余弦法计算出的相似度值人参、黄芩未见明显变化。
（3）把“平均值样品”中的小峰减少25%，样品保留原有的色谱峰数据不变，也就是样品比“对照指纹图谱”的色谱峰数量多出25%。相似度计算结果表-3中D项。从表-3中D项可以看出，相关系数法计算出的相似度值，人参小于0.9的样品由2个增加到4个，有解答的影响；夹角余弦法计算出的相似度值人参、黄芩未见明显改变。
对中药指纹图谱中小色谱峰的变化对数学相似度的影响分析可以得知，相关系数法计算出的相似度值变化较大，说明相关系数法能对小色谱峰的变化能作出反应；夹角余弦法对小色谱峰的反应不敏感。从结果中同时也可以看出，中药“对照指纹图谱”的色谱峰数量多于样品时，数学相似度的变化较小，说明各成应分尽可能分开的重要性，这样在以后的检验中，即使实验室误差对小色谱峰产生一些影响，对指纹图谱相似度值的影响也要小于未能较好地分离各色谱峰的色谱条件所制定出“对照指纹图谱”。
2.2 化学成分变异对指纹图谱数学相似度的影响
以人参、黄芩的HPLC色谱数据模拟中药化学成分的变异，研究化学成分的变异与指纹图谱数学相似度值的关系。对人参、黄芩所含的几种主要化学成分进行缺失或互换处理，并与“平均值样品”进行相似度分析，结果见表-4。
表-4  模拟化学成分变异的相似度分析
品种
化学成分处理方法
占总峰面积的%
相关系数
夹角余弦
人
参
原来的相似度值
2个    <0.9
0个    <0.9
去掉13号峰数据
16.7
15个    <0.9
15个    <0.9
去掉Rg1数据
13.4
15个    <0.9
15个    <0.9
去掉Re数据
8.3
12个    <0.9
2个    <0.9
Rg1与Re互换数据
8个    <0.9
3个    <0.9
黄
芩
原来的相似度值
0个    <0.9
0个    <0.9
去掉黄芩苷数据
58
15个    <0.9
15个    <0.9
去掉黄芩素数据
13
0个    <0.9
0个    <0.9
去掉汉黄芩苷数据
9
0个    <0.9
0个    <0.9
黄芩素与汉黄芩苷数据互换
0个    <0.9
0个    <0.9
从表-4可以看出，人参这类各成分含量较平均分布的中药品种，一个占总峰面积5%以上成分的缺少，就会引起相似度值的较大改变。而黄芩这类1种主要成分（黄芩苷）占大部分总峰面积的品种，黄芩素与汉黄芩苷占总峰面积的比例虽然也大于5%，它的缺失却未引起相似度值的明显改变。说明在单一成分占主导地位的特殊中药品种内，指纹图谱的数学相似度主要由占主导地位的化学成分所决定，但一般情况下，含量占总量5%的化学成分的变异，就能对指纹图谱的数学相似度值产生较大的影响。
3. 结论与建议
3.1 中药”对照指纹图谱”的可行性探讨
人参、黄芩HPLC指纹图谱的模拟比较研究说明，虽然中药“平均值样品”是一批质量较好的样品各色谱峰数据的平均值在色谱处理机上模拟出的一个指纹图谱，但作为“对照指纹图谱”使用，可以使样品与它之间的相似度达到最大化，有较好的代表性，同时也更适合于计算机对指纹图谱数学相似度的自动比较，比中药“标准提取物”有更大的使用价值。如果在中药质量标准中采用指纹图谱并规定进行指纹图谱的相似度评价，“对照指纹图谱”应用在中药质量标准中具有更大的可行性。
中药指纹图谱中小色谱峰与大色谱峰的变化对数学相似度的影响是不同的，小色谱峰对指纹图谱的相似度影响较小，说明不同实验室之间存在的一些小误差不会对指纹图谱的数学相似度产生较大的影响；但一个占总峰面积5%以上化学成分的变化一般会引起指纹图谱相似度的较大改变。此外，指纹图谱在数学上具有较高的相似度，并不能说明它们之间质量的相同，只有在中药所含化学成分总量相等的前提下，具有较高的数学相似度才是质量的相似。
在中药“对照指纹图谱”中使用相对保留时间和峰面积比值可以进行量值的传递，使用各色谱峰与对照物质的峰面积比值是因为“对照指纹图谱”是一个模拟的指纹图谱，考虑到各实验室的仪器、对照品浓度、样品取样量等存在一定的差异，使用与对照品的峰面积比值可以消除系统误差，使“对照指纹图谱”中的峰面积比值能在各实验室之间被准确地传递。
3.2 标准中样品与“对照指纹图谱”数学相似度的确定
中药标准中样品与“对照指纹图谱”相似度的确定，取决于中药品种内整体化学成分的相似性。当发现样品与“对照指纹图谱”之间的相似度较小时，首先应考虑制定“对照指纹图谱”的样品是否具有代表性。当中药材分布区较广而样品来源地集中时，各色谱峰数据的平均值会偏向于集中来源地的样品，此时应对研究用样品进行系统聚类分析，依此重新选择有代表性的样品来确定“对照指纹图谱”。确定中药指纹图谱的相似度必须以各品种的实际研究数据为准，那些同品种内化学成分变异较大的中药指纹图谱的研制和统一，才是能否在中药标准中使用数学模型进行指纹图谱相似度评价所面临的最大难题。
当发现中药样品与“对照指纹图谱”之间的数学相似度较小时，有2种解决问题的方法：（1）统一降低中药各品种样品与“对照指纹图谱”之间的数学相似度值；（2）在明确证明了某中药品种内整体化学成分相似性较小时，在标准中降低这个品种样品与“对照指纹图谱”之间的数学相似度，即具体品种分别对待。
最后，中药指纹图谱的应用是中药质量控制的一大进步，指纹图谱作为中药质量控制的一种先进方法是中药现代化发展的必然趋势和要求。在中药质量标准中指纹图谱定位在什么范畴，即中药指纹图谱起什么作用，是定性、全成分的定量，需要具体品种的研究数据来说明，在现阶段不能对指纹图谱的要求规定得太精确，应该把质量控制的重点放在真实投料、工艺稳定上。定性与少数个别成分的定量相结合也许是现阶段较为可行的办法。