:第四章　微生物的营养和培养基

营养或营养作用(nutrition)：生物体从外部环境吸收生命活动所必需的物质和能量，以满足其生长和繁殖需要的一种生理功能。

参与营养过程并具有营养功能的物质称为营养物(nutrient)。

第一节 微生物的营养要素

一 碳源 (carbon source)
指一切能满足微生物生长繁殖所需碳元素的营养物。

总体上，微生物能利用的碳源的种类及形式极其广泛多样（参P83表），但不同微生物对碳源的利用因种不同而差异悬殊；

对于利用有机碳源的异养型微生物来说，其碳源往往同时又是能源。此时，可认为碳源是一种具有双功能的营养物。还有一些种类较少的自养型微生物，则以CO₂为主要碳源；

工业发酵生产中所供给的碳源，大多数来自植物体，如山芋粉、玉米粉、麸皮、米糠、糖蜜等，其成分以碳源为主，但也包含其他营养成分。实验室中，常用于微生物培养基的碳源主要有葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉、甘露醇、甘油和有机酸等。

二 氮源 (nitrogen source)
指一切能满足微生物生长繁殖所需氮元素的营养物 (参P84表）。

工业发酵中利用的有机含氮化合物，主要来源于动物、植物及微生物体，例如鱼粉、黄豆饼粉、酵母提取物、发酵废液及废物中的菌体等。铵盐、硝酸盐、蛋白胨和肉汤等则是实验室培养微生物常用的氮源。

三 能源 (energy source)
指能为微生物生命活动提供最初能量来源的营养物或辐射能。

能作为化能自养微生物的能源都是一些还原态无机物，如NH4⁺、NO2^–、S、H₂S、H₂和Fe₂⁺等。能氧化利用这些物质获得能量的微生物都是细菌，如亚硝酸细菌、硝酸细菌、硫化细菌、硫细菌、氢细菌和铁细菌等。由于化能自养微生物的存在，说明生物界的能源并非都是直接或间接的依靠太阳能。

四 生长因子（growth factor）

某些微生物生长所必需、其自身又不能合成或合成量不足以满足自身生长，需要外源提供的微量有机物。狭义的生长因子一般仅指维生素；广义的生长因子除维生素外，还包括氨基酸、碱基、脂肪酸等。

根据各种微生物与生长因子的关系可分以下几类（了解）：生长因子自养型微生物、生长因子异养型微生物、生长因子过量合成型微生物、生长因子缺陷型微生物。

通常由于对某些微生物所需的生长因子不了解，因此常在培养这些微生物的培养基里加入酵母膏、牛肉膏、玉米浆、肝浸液、麦芽汁或其他新鲜的动植物组织浸出液等物质以满足它们对生长因子的需要。

五 无机盐（inorganic salt，mineral salt）

无机盐或矿质元素主要为微生物提供除C、N源以外的各种生物元素。

凡生长所需浓度在10^-3～10^-4mol/L范围内的元素，称为大量元素，如P、S、K、Mg、Ca、Na、Fe等；凡生长所需浓度在10^-6～10^-8mol/L范围内的元素，则称微量元素，如Mn、Zn 、Cu、Cl、Co、Mo、Ni、B、W、 Sn、Se等。不同微生物有时所需的无机盐浓度有时差别很大，上述划分只是使用上的方便。　

无机盐的生理功能（参P86表，了解）

在配制微生物培养基时，对于大量元素，可加入相关化学试剂，常用 K₂HPO₄ 及 MgSO₄ ，它们可提供 4 种需要量最大的元素。对于微量元素，由于水、化学试剂、玻璃器皿或其他天然成分的杂质中已含有可满足微生物生长需要的各种微量元素，因此在配制普通培养基时一般不再另行添加。但如果要配制研究营养代谢等的精细培养基，所用的玻璃器皿应是硬质的，试剂是高纯度的，此时就须根据需要加入必要的微量元素。

六  水（water）

微生物对水分的吸收或排出决定于水的活度。水活度用a_w (activity of water)表示，即一定温度和压力下，溶液的蒸汽压 ( p )和纯水蒸汽压( p_o ) 之比：a_w　=　p／p o（参P93-94)

微生物生长所要求的a_w值，一般在0.60~0.99之间，每一种微生物的生长都有一适应范围及最适的a_w值，且这个a_w值是相对恒定的。如果微生物生长环境的a_w值大于菌体生长的最适a_w值，细胞就会吸水膨胀，甚至引起细胞破裂。

反之，如果环境a_w值小于菌体生长的最适a_w值，则细胞内的水分就会外渗，造成质壁分离，使细胞代谢活动受到抑制甚至引起死亡。为了抑制有害微生物生长，往往加入高浓度食盐或蔗糖，降低环境中的a_w值，使菌体不能正常生长，从而达到长久保存食品的目的。

第二节  微生物的营养类型

根据微生物生长所需要碳源的性质，可将微生物分成自养型（autotroph）与异养型（heterotroph）两大类；又可根据微生物生长所需能量来源不同可分成化能营养型(chemotroph)与光能营养型 (phototroph)；还可根据其生长时能量代谢过程中氢供体性质的不同来分，将微生物分成有机营养型（organotroph）与无机营养型(lithotroph)。

综合起来，可将微生物营养类型划分为四种基本类型，即化能有机营养型（化能异养型）、化能无机营养型（化能自养型）、光能有机营养型（光能异养型）与光能无机营养型（光能自养型）。(参P87表)

第三 节营养物质进入细胞的方式

微生物没有专门的摄食器官，各种营养物质直接通过细胞膜的渗透和选择性吸收进入细胞。营养物质从微生物所处的周围环境通过细胞膜进人细胞的方式，可分为四种类型，即简单扩散、促进扩散、主动运输和基团转位。(参考P89表和P90图)。

1.简单扩散

是一种最为简单的营养物质吸收进入细胞的方式。在简单扩散中，营养物质在扩散通过细胞膜的过程中不消耗能量，也不发生化学变化。物质扩散的动力是物质在膜内外的浓度差；通过细胞膜中的含水小孔由高浓度的胞外环境向低浓度的胞内扩散，这种扩散是非特异性的；但膜上小孔的大小和形状对被渗透扩散的营养物质的分子大小有一定的选择性。

简单扩散不是微生物吸收营养物质的主要方式，以这种方式运输的物质主要是一些分子量小与脂溶性的物质。如水、一些气体（如氧）、甘油和某些离子，如大肠杆菌以简单扩散方式吸收钠离子等。

2.促进扩散

营养物质经促进扩散进入细胞的运输过程中，需要借助位于膜上的一种载体蛋白的参与，并且每种载体蛋白只运输相应的物质。因此，促进扩散对被运输的物质具有高度专一性，被传送的物质先在细胞膜外面与载体蛋白结合，然后在细胞内表面释放。载体蛋白能促进物质运输加快进行，但营养物质仍不能逆浓度梯度吸收。促进扩散的运输方式多见于真核微生物，例如酵母菌，某些物质的吸收和代谢产物的分泌是通过这种方式完成的。

3.主动运输

需消耗能量，且可逆浓度梯度运输，是一种广泛存在于微生物中的主要物质运输方式。与上述促进扩散方式不同，在主动运输中，载体分子构型变化以消耗能量为前提。微生物在生长与繁殖过程中所需要的多数营养物质如氨基酸等主要是通过此方式运输的。

4.基团移位

一种既需要载体蛋白又需要消耗能量的物质运输方式。与主动运输方式不同的是它有一个复杂的运输酶系统来完成物质的运输，同时底物在运输过程中发生化学结构变化。这种运输方式主要存在于厌氧细菌和兼性厌氧细菌中，主要用于糖的运输以及脂肪酸、核苷、碱基等物质的运输。

第四节  培养基

自学内容要求：

 一  选用和设计培养基的原则和方法

掌握：选用和设计培养基的4个原则和4种方法；碳氮比、水活度的概念；不同渗透条件对微生物细胞的影响；培养基pH内源调节的方法。

了解：各大类微生物（从整体看）最适生长的pH范围、生长最低aw值；微生物对氧化还原电势的要求。

二培养基的种类

掌握：培养基的分类方法；各种培养基的性质、优缺点及其应用；选择性培养基的设计原理和方法；EMB培养基的原理。

了解：琼脂作为凝固剂的优点

一 培养基配制应遵循的原则

① 根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基；

② 控制好不同营养物质的浓度和比例，保持合适的pH、氧化还原电势、渗透压或a_w；

在实践中，针对某些微生物在生长过程中产酸性或碱性代谢产物较多的情况，在配制培养基时常添加一些缓冲剂或不溶性的碳酸盐，以维持培养基pH的相对稳定；常用的缓冲剂是K₂HPO₄与KH₂PO₄组成的混合物或CaCO₃。

③ 培养基配制后应尽快灭菌；

④ 经济节约(生产上)。在所选培养基成分能满足微生物培养要求的前提下，一般尽可能选用价格低廉，资源丰富的材料作培养基成分。

二 培养基的类型

培养基种类很多，可根据构成培养基的成分、物理状态、用途将培养基分成若干类型。

1. 合成、半合成与天然培养基

根据构成培养基的化学成分的了解程度，可将培养基分成合成、半合成和天然培养基三大类。

（1）天然培养基(complex media, undefined media)

指用化学成分并不十分清楚或化学成分不恒定的天然有机物质配制而成培养基。常用的有机物有牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、麦芽汁、豆芽汁、玉米粉、麸皮、牛奶、血清等。如实验室常用于培养细菌的牛肉膏蛋白胨培养基等就属于此类培养基。

优点是营养丰富、种类多样、配制方便、价格低廉；缺点是成份不十分清楚、不稳定。因此，通常只适用于一般实验室中的菌种培养、发酵工业中生产菌种的培养和某些发酵产物的生产等。

（2）合成培养基（synthetic media）

又称组合培养基。它是由化学成分完全了解的物质配制而成的培养基。例如用于分离培养放线菌的高氏1号培养基，其组成分均为明确已知的化学成分。

优点是成份精确、重演性高；缺点是价格较贵、配制麻烦，且微生物生长较一般，因此，通常仅适用于营养、代谢、生理、生化、遗传、育种、菌种鉴定或生物测定等对定量要求较高的研究工作中。

（3）半合成培养基（semi-synthetic media）

又称半组合培养基。是指一类主要用已知化学成分的试剂配制，同时又添加某些未知成分的天然物质制备而成的培养基。如一般用于培养霉菌的马铃薯蔗糖培养基。

2. 液体、固体与半固体培养基

根据其物理状态将培养基分成液体、固体培养基与半固体培养基等类型。

（1）液体培养基（liquid media）

指呈液体状态的培养基。无论在实验室还是生产实践中，液体培养基被广泛应用。尤其是工业生产上，液体培养基被用于培养微生物细胞或获得代谢产物。

（2）固体培养基（solid media）

即指呈固化状态的培养基。根据固态性状，又可分为以下几种类型：

① 固化培养基也称固体培养基，是由液体培养基中加入凝固剂而成。琼脂（agar）（融化温度、凝固温度分别约为96℃和 40℃）是最优良且应用最广泛的凝固剂。常在液体培养基中加入1％~2%的琼脂配制固体培养基。

② 不可逆固体培养基这类培养基一旦凝固就不能再被融化，故称之为不可逆固体培养基。如医学微生物分离培养中常用的血清培养基及用于化能自养细菌的分离、纯化与培养的硅胶培养基等。

③ 天然固体培养基指由天然固态营养基质制备而成的固体培养基。常用的天然固态营养基质有麦麸、米糠、木屑、植物桔杆纤维粉、马铃薯片、胡萝卜条、大豆、大米、麦粒等。如食用菌生产常用植物秸杆纤维粉为主要原料的天然固体培养基。

④ 滤膜  即一种坚韧且带有无数微孔的醋酸纤维薄膜。将滤膜制成圆片覆盖在营养琼脂或浸有液体培养基的纤维素衬垫上，就形成具有固化培养基性质的培养条件。滤膜主要用于对含菌量很少的水中微生物进行过滤、浓缩，然后揭下滤膜，放于含合适培养基的衬垫上培养，根据长出的菌落数，可算出水样中的实际含菌量。

固体培养基在科研和生产实践上用途广泛，如菌种分离、鉴定、菌落计数、检验杂菌、选种、育种、菌种保藏、生物活性物质的生物测定，获取大量真菌孢子，以及用于微生物的固体培养和大规模生产等。

（3）半固体培养基(semi-solid media)

在液体培养基中加入少量凝固剂而制成的坚硬度较低的固体培养基。一般常用的琼脂浓度为0.2％ ~0.7%。半固体培养基常用于细菌运动性观察、趋化性研究、厌氧菌培养、分离和计数，细菌和酵母菌的菌种保藏，以及双层平板法测定噬菌体效价等。

3. 选择与鉴别培养基

根据培养基对微生物的功能可分为选择性培养基和鉴别性培养基等。

（1）选择性培养基（selective media）

根据某些微生物的特殊营养要求或其对化学、物理因素的抗性而设计的培养基，具有使混合菌中的劣势菌变成优势菌的功能，广泛用于菌种筛选等领域。

选择性培养基配制时可根据不同的用途选择特殊的营养成分或添加特定的抑制剂，以达到分离特定微生物的目的。在实践中有两种方式，一种是正选择（投其所好），另一种是反选择（取其所抗）。

正选择是添加某种特定成分为培养基主要或唯一的营养物，以分离能利用该种营养物的微生物。如从混杂的微生物群落中选择性地分离能利用纤维素的微生物时，则把纤维素作为选择培养基的唯一碳源，把混杂的微生物群落样品涂布于此种培养基上，凡能在该培养基上生长繁殖的微生物即为能利用纤维素的微生物。以此类推，可以分离利用各种各样营养物的微生物。

反选择是在培养基中加入某种或某些微生物生长抑制剂，以抑制所不希望出现的微生物，从而从混杂的微生物群体中分离不被抑制和所需要的目标微生物。如在选择培养基中加入青霉素、链霉素以抑制细菌，从而分离霉菌与酵母菌；在基因工程中，也常用加入抗生素的选择培养基来筛选带有抗生素标记基因的基因工程菌株或转化子。

（2）鉴别性培养基（differential media）

用于鉴别不同类型微生物的培养基。如在培养基成分中加有能与目的菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂，从而达到只须用肉眼辨别颜色就能方便地从近似菌落中找出目的菌菌落的培养基。

鉴别培养基主要用于微生物的分类鉴定和分离或筛选产生某种或某些代谢产物的微生物菌株。

如伊红美蓝（Eosin Methylene Blue，EMB）培养基中的伊红和美蓝两种苯胺染料可抑制G^＋菌和一些难培养G^－菌。在低酸度下，这两种染料会结合并形成沉淀，起着产酸指示剂的作用。因此，试样中多种肠道细菌会在EMB培养基平板上产生易于用肉眼识别的多种特征性菌落，特别是E.coli因其能强烈分解乳糖而产生大量混合酸，表面带H^＋，故可染上酸性染料伊红，伊红与美蓝结合使菌落呈现深紫色，且从菌落表面的反射光中还可看到似金龟子色的绿色金属闪光。

关于选择性、鉴别性培养基只是为应用方便而人为划分的。实际应用时两种功能常结合在一起，如EMB培养基既是鉴别性培养基又是选择性培养基。

本章思考题

1.名词解释：异养菌、自养菌、生长因子、生长限制因子、碳氮比、培养基、天然培养基、组合培养基、选择性培养基、鉴别性培养基、EMB培养基。

2.试述微生物营养中的6大要素物质及其生理功能。

3.什么是碳源？什么是氮源？工业发酵和实验室常用的微生物碳源和氮源物质分别有哪些？

4.何谓培养基？根据对培养基成分的了解程度、外观物理状态和对微生物的功能分别可分为哪几种类型？其特点和用途径分别如何？

5.比较微生物吸收营养物质四种方式的异同点。

6.试举细菌、放线菌和真菌培养基各一种，并指出每一种培养基中各组分的功能。

7.如果要从自然界中分离特定类型的微生物(如降解某种农药的细菌、耐酒精的酵母菌)，你如何根据所学知识去选用或配制适合的培养基？