雨后故事邪恶动态图片:蛋白質序列分析

MS蛋白質序列分析

一、質譜儀（MS）如何運作

二、MALDI-TOF MS

三、MALDI的優缺點

四、ESI tandem MS

五、Tandem Mass Analyzers

六、Ion-Trap Mass Analyzers

一、    質譜儀（MS）如何運作

目前有兩種設備用於蛋白質體學的質譜儀（MS）實驗，一種是MALDI-TOF MS（matrix-assisted laser desorption inoization-time of flight mass spectrometry），一種是ESI-tandem MS（electrospray ionization-tandem mass spectrometry），前者可獲得peptide質量的資訊，後者可獲得peptide片段詳細的資料。雖然兩種操作的方式截然不同，但得到的結果都具有高度準確性，專門研究蛋白質體學的實驗室，會將兩種皆列為必要的設備。

MS本身有三個主要部份，如下圖所示：

第一個部份是來源（source），由樣品產生離子；第二個部份是質析（mass analyzer），依離子質量/價數【mass/charge（m/z）】的比例分開它們；第三個部份是偵測（detector），也就是mass analyzer的結果。簡單說來，質譜儀就是將一群混合物轉為離子，再依照m/z分析它們，得到的結果由儀器自動記錄下來，交給電腦分析。

怎樣的MS適合？有三個重點，第一是敏感度（sensitivity），多數的蛋白質體研究中，所能得到的蛋白質量都有限，所以儀器最好能敏感到能偵測10^-15莫耳的peptide；第二是解析能力（resolution），從極小的m/z值分辨不同離子，最好能區別m/z值差別在0.001 amu以下的樣品，限於經費，這樣的儀器其實不普遍，常用的大概在1 Da（一個氫原子的質量）左右；第三是精密度（mass accuracy），測得的peptide離子或片段愈接近真實狀況愈好。

二、    MALDI-TOF MS

MALDI（matrix-assisted laser desorption inoization）代表來源（source），也就是離子化的部份，TOF是time of flight的縮寫，代表質析（mass analyzer），整個運作方式如下：

A：將待測物peptides與一些化學物質（圖中的matrix）混合，matrix中的微小分子，會吸收特殊波長的光，成份包括2,5-dihydroxybenzoicacid、3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid（sinapinic acid），以及α-cyano-4-hydroxycinnamic acid。混合物置於小玻片上，讓水份或其它溶劑揮發到空氣中，造成樣品內部晶格（crystal lattice）的形成，再把樣品放到source的部份，source這兒提供雷射光，matrix的化學物質吸收光子而激發電子，釋放的能量轉到樣品中的peptide上，離開matrix表面進入空氣中。這樣的離子化過程，依樣品的性質，產生正離子或負離子，在蛋白質體學的研究中，通常正離子是我們所感興趣的部份，正離子的產生是在脫離matrix的過程中，接受了質子所致。每一個peptide分子會接受單一的質子，因此，大部份的peptide離子都會帶一個正電，比如一個質量1032的peptide接受了一個質子後，變成【M+H】⁺的狀態，m/z質成為1033。在MALDI形成這樣的離子後，再送入TOF mass analyzer分析。

B：TOF（time of flight）正如其名，能測得離子由analyzer一端到另一端（detector）的時間，m/z值愈大，時間愈短。MS的優劣是在於能區別離子間微小m/z的差異，但是這種測量直線行進速度的TOF解析力不夠高（以人的眼睛狀況比喻，解析力差的MS就像近視），造成直線型TOF低解析力的原因，在於相同m/z值的離子，直線行進速度也有快慢之別。

C：改良式的TOF，以反射取代直線法。它能使離子經反射而聚焦，擁有相同m/z值的離子便會在同時抵達偵測器。

下面以分析胰島素的例子，說明反射式與直線式的MALDI-TOF得到的結果：

A：反射型的TOF，輕易區分出peptide中的¹²C和帶有放射性的¹³C。

B：直線型的TOF，只能測出peptide的平均m/z值。

另一種改善直線型TOF缺點的方法是，使用間歇性雷射光讓樣品離子化，如此一來會延遲它們進入TOF的時間，使所有離子的起跑點一致，相同m/z值的就會在相同時間到達偵測器了。改良後的MALDI-TOF能區別m/z值只差0.001 amu的樣品。

在分析的時候，調整反射處（reflectron）的電壓，使peptide ion的加速度和電離（ionization）過程適時緩和下來，穿越TOF的時間不會太快也不會太慢，這種方法稱為PSD（post-source decay），雖然PSD不是分析peptide 序列最好方法，但是它可以測得完整的質量，尤其是H₂N⁺=CHR的R（氨基酸支鍊side chain）部份。

三、    MALDI的優缺點

世上並沒有完美的MS機種，但是MALDI-TOF MS有四大優勢：第一，操作簡便，它的操作介面人性化，使用者較易上手，是所有MS中最容易學會的一種，在資源共享的實驗團隊裡，它可以在一天之內分析上百件樣品。第二，需要大量製備蛋白質樣品的地方，目前從2D 電泳膠體的製作、蛋白質點（protein spots）的取出及酵素水解，都採用自動化的設備，MALDI-TOP也能以這樣的形式存在，減少人力、提高效率。第三，隨著TOF分析方式的改良，得到的蛋白質體數據也愈正確。第四，MALDI-TOF MS的靈敏度高，可以偵測到少量的（可到10^-18 mole）蛋白質。

雖然MALDI-TOF MS有這麼多好處，有時我們仍會使用其它種類的MS，這是因為MALDI-TOF MS可以提供正確的「質量（mass）」資訊，卻不能獲得詳細的「序列（sequence data）」結果，PSD的改良固然使MALDI-TOF MS能看到序列，詳盡與正確度仍不及ESI tandem MS（electrospray ionization-tandem mass spectrometry）。除此之外，分析的成敗，幾乎取決於樣品當初製備的品質如何，如果樣品在水解過程被金屬、鹽類、尿素、丙醇污染，或是界面活性劑（detergen）沒有去除乾淨，都會使樣品在MALDI source的電離（ionization）受到極大的影響。當然，樣品的污染會影響所有的MS分析，不過MALDI-TOF MS對此特別敏感，因為它沒有再經HPLC系統去除雜質的步驟。

四、    ESI tandem MS

ESI-tandem MS（electrospray ionization-tandem mass spectrometry）又稱為ESI-MS-MS，ESI是離子產生的過程，tandem mass spectrometry是分析離子質量的地方，分為兩個或更多個步驟。和MALDI 中晶格化的樣品不同，ESI的樣品是放在溶液中的，溶液pH值的高低，控制了樣品的官能基（functional group）離子化的狀況，pH值約高於5，C-terminal的部份才會離子化，pH值低於7的時候，N-terminal及氨基酸hitidine的氮才會游離，lysine和arginine的N端通常要低於pH8.5才會離子化，這表示在酸性溶液中（如pH3.5或更低）會使蛋白質帶正電，在鹼性環境中則讓蛋白質帶負電，ESI一般都在酸性環境下分析帶正電的peptide ion。

在分析前，使用胰蛋白酶（trypsin）水解蛋白質的結果，因為酵素切點的位置，使作用完的peptides裸露出lysine、arginine部份，加上低pH值的環境，這些peptides變成帶有多個正電的狀態。舉例來說，帶有一個質子的20kDa（m/z = 20,001）蛋白質，其實在溶液中可以接受10~30個質子，因此這些蛋白質分子有的含有20個質子，m/z值為20,020/20=1001；有的含有21個質子，m/z值是20,021/21=953；有的含19個質子，m/z值是20,019/19=1053。ESI mass specgrum之所以被稱為「多價封套（multicharge envelope）」，正是因為它能捕捉到不同價數的蛋白質狀態，下圖是以此法分析牛的apomyoglobin結果：

再透過軟體，將這些訊息顯示為真正的蛋白質質量：

較小的蛋白質（250~2500 Da）依其大小及鹼性氨基酸多寡，通常以一至三價混合離子的形式存在，拿胰蛋白酶切完產生的peptide 「DAFLGSFLYEYSR」為例，ES-MS分析的結果如下：

一價的m/z為1567.9，二價的離子m/z為784.7。

ESI source的構造較簡單，樣品通常由HPLC純化出來後，流入source的地方，經過高電壓的不繡鋼管或針頭，以滴狀物的形式噴出，每一滴都含有胜肽離子（peptide ions）和HPLC的移動相物質，如水、acetonitrile 、acetic acid等。接著，source以加熱或給予氮氣的方式，分開peptide ions與其它物質，將peptide ions送入analyzer分析，其他物質以抽真空的方式排出。整個流程如下圖所示：

五、    Tandem Mass Analyzers

在蛋白質體學研究中，目前有三種分析儀（analyzer）搭配ESI source使用，分別是triple quadrupole（又稱為triple quad）、ion trap和quadrupole-time of flight（Q-TOF）。三種的運作方式雖有差別，共同點是會選擇source送來的peptide ion 其中一種m/z值，以撞擊引發解離作用（collision-induced dissociation，CID），peptide ion片段化且變成電中性，分析m/z值後產生離子光譜（ion spectrum），由tandem 或MS-MS光譜的資訊，可以推知peptide的序列，由MS-MS spectrum還可以知道序列的何處經過修飾。

Triple quad是首用於蛋白質體學研究的tandem MS，含有4個平行排列的金屬柱：

金屬柱的電流和電壓方向，使離子以螺旋狀軌道行進，唯有具備特定的m/z值的離子能穿越，大於或小於此m/z值的離子無法順利穿越：

由source來的離子會先經過第一個quadrupole（Q1）作快速掃瞄（rapid scanning），記錄下所有時間通過的所有離子m/z值，這種模式為「full-scan mode」：

我們也可以調整Q1電壓，讓它成為一個「質量過濾器」（mass filter），只能讓特定的m/z值離子通過，這些離子進入第二個quadrupole（q2）後，經argon原子的碰撞而裂解化（fragmentation），在第三個quadrupole（Q3）分析m/z值，這種模式稱為「MS-MS mode」，MS-MS 分析的效果，和Q1電壓的設定、q2中Ar 氣壓的大小、CID（collision-induced dissociation）的能量給予，有很大的關聯性。它的流程如下：

Q-TOF 和triple quad大致相似，唯它的Q3部份是TOF mass analyzer。

六、    Ion-Trap Mass Analyzers

Ion-trap mass analyzer的作用原理和triple quadrupoles有很大的不同，後者是在離子飛行穿越管子的時候分析它們，前者則是收集並儲存離子後再分析之。由 source來的離子會直接進入ion trap，trap的兩端有電極，中間是環狀的電極，構造如下圖：

Trap的大小和葡萄差不多，它將收集到的離子保存在軌道上，以氦氣作冷卻劑，使離子的能量散佈均勻，並循序析出離子，：

為了呈現所有在trap中離子的質譜，它會不斷進行「讓trap充滿離子」、「依m/z值掃瞄出離子」的循環，和前面提過的triple quadrupole不同，triple quadurpole是作出連續性的分析，ion trap則是作有規律性的間歇式分析。當目標離子進入，trap的電壓會加高，使離子受到衝擊產生fragmentation：

產生的fragments被trap「捕捉」，依m/z值分析：

Ion-trap的解析力很高，如果將掃描的速度調慢，它能分辨0.05 unit的m/z值差異，在自動化操作的過程中，若再搭配限制質量，甚至能在MS-MS分析前就得知離子的價數狀況（charge state），這對peptide的定序相當有利。

※參考資料: Daniel C. Liebler    Introduction to Proteomics-Tools for the New Bioloogy  P55~76

             Humana Press Inc. (2002)

整理: 施純如