探讨人参及西洋参栽培土壤微生物种群结构的遗传多样性

　　1 引言
　　
　　人参（Panax ginseng C. A. Meyer）系我国传统名贵中药材，具有强烈的忌连作特性，栽过人参的土地（俗称老参地）30～40年内无法重茬栽参，否则易出现严重的烧须、烂根、病害高发等问题，严重者甚者造成绝收。针对人参连作障碍问题，前人从土壤理化性状[1]、营养成分[2,3]、土壤微生物生态[4]、病菌积累[5]、化感作用[6]等方面开展了大量而深入的研究，但其形成及作用机制迄今尚不明确。土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分，其在物质与能量循环、土壤结构保持、土壤微生态平衡等方面发挥重要作用[7]。土壤微生物种群多样性是评价土壤微生态环境变化的重要指标，开展与人参连作障碍以及与人参土传病害密切相关的老参地土壤微生物种群结构研究，对于阐明土壤微生物种群遗传多样性在土壤微生态平衡保持中的作用意义重大。
　　土壤微生物传统分析方法建立在菌物培养的基础上，受多种因素制约，可培养的微生物仅占土壤微生物总数的极小比例（约1%～5%）[8,9]。借助传统的菌物培养方法难以真实、客观地反映土壤微生物种群结构。随着科学技术的进步，许多基于高通量组织培养（如：BIOLOG）、化学分析（如：PLFA）以及PCR扩增（如：DGGE、T-RFLP）等现代生态学研究方法不断涌现，并成功应用于土壤微生物遗传多样性、物种鉴定、系统进化、生态功能分析等研究领域[10-14]。RAPD（Randomly Amplified Polymorphic DNA）是用于土壤微生物种群分析的有效方法之一，其具有操作简单、费用低廉、通用性好等优点；RAPD引物能够与土壤微生物基因组DNA特定位点随机结合，从而达到扫描微生物全基因组的目的。该方法自创建至今，已被广泛应用于动物、植物及微生物基因组水平的遗传多样性研究。
　　本研究在前期已经研究的基础上[15-17]，利用RAPD方法对采自人参、西洋参生产基地集的根际土及根围土微生物种群开展了遗传多样性研究；另外，通过比较不同年生人参及西洋参根区土壤微生物种群结构差异，探讨了人参栽培过程中土壤微生物种群结构的特征性变化，为深入探究人参连作障碍的形成机制奠定了理论基础。
　
　　2 材料与方法
　　
　　2.1土壤样品
　　供试土壤样品共计18份，均采自吉林省抚松县新屯镇黄泥村（北纬42°31′54.2″，东经:127°15′45.8″，海拔581.6 m）。供试土壤样品均为黄土，分别采自人参、西洋参的根际及根围。每份土壤样品均通过多点取样获得，取后直接装入自封袋，采回土样随即进行了土壤微生物基因组DNA的提取，-20℃保存备用。
　　2.2土壤微生物RAPD分析
　　土壤微生物总DNA提取及RAPD反应体系参见应益昕等[18]。PCR反应体系为25 μL，包括17.9 μL超纯水（ddH2O），2.5 μL 10×PCR缓冲液（100 mmol/L Tris，500 mmol/L KCl，20 mmol/L Mg2+，pH8.3），1.5 μL RAPD引物（10 μmol/L）；1.5 μL dNTP（2.5 mmol/L），0.6 μL Taq DNA聚合酶（2.5 U/μL），1 μL模板DNA（约15 ng）。本文利用从200条RAPD引物中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的24条RAPD引物对样品中的土壤微生物种群进行了遗传多样性分析。
　　PCR反应在BIOMETRA TGRADIENT 96型扩增仪上完成。扩增程序为：94℃ 1 min；94℃ 1 min，37℃ 1 min，72℃ 1.5 min，40个循环；最后，72℃延伸7 min。扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳及EB染色处理后，在BIO-RAD紫外凝胶成像仪上观察、拍照。
　　2.3数据采集及分析
　　根据RAPD扩增产物的电泳结果，在迁移位置相同的琼脂糖凝胶上无DNA条带记为0，有DNA条带记为1。用POPGENE Version 1.31软件计算多态位点百分率、观察等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、Neis基因多样性指数（He）、Shannon信息指数（I）。用NTSYSpc Version 2.10e软件中的非加权平均数（Unweight Pair-Group Method using arithmetic Averages，UPGMA）方法对统计数据进行聚类分析。
　　
　　3 结果与分析
　　
　　3.1土壤微生物RAPD扩增评价
　　以试剂盒纯化的土壤微生物基因组DNA为模板，经PCR扩增，共扩增出359条清晰、可辨的RAPD扩增条带，其中多态性条带324条，多态性率高达90.25%，扩增片段的长度介于200～900 bp之间。每条RAPD引物扩增的DNA条带数介于7～24之间，平均每条引物可扩增出13.5条多态性条带。其中，RAPD引物OPJ01扩增出的多态性条带最多（23条），RAPD引物OPR8扩增出的多态性条带最少（7条）。为RAPD引物OPR11在18份土壤微生物样品中的扩增图谱。琼脂糖凝胶电泳结果表明，筛选出的24条RAPD引物可在土壤样品间扩增出丰富的多态性条带，能够用于供试土壤的微生物种群遗传多样性分析。
　　3.2微生物种群遗传多样性分析
　　有效等位基因数目（Ne）和Neis基因多样性指数（He）是遗传多样性研究中最常用的衡量指标，具有重要的遗传学意义。Shannon信息指数本身没有遗传学意义，但方便与同类研究进行比较。利用POPGEN Version 1.32软件对土壤微生物种群遗传多样性分析结果表明，18份土壤样品的平均观察等位基因数为1.9753，平均有效等位基因数为1.4463，平均Neis基因多样性指数为0.2776，平均Shannon信息指数为0.4335。就不同土壤样品而言，其土壤微生物种群的遗传多样性存在较大差异，有效等位基因数最大值为1.6502，最小值仅为1.2738；Neis基因多样性指数最大值为0.3666，最小值为0.1980；Shannon信息指数最大值为0.5392，最小值为0.3389，表明不同土壤样品的微生物种群间存在较丰富的遗传变异。
　　3.3基于微生物种群遗传多样性的聚类分析
　　根据18份土壤样品的微生物种群和359个RAPD扩增位点的原始统计数据矩阵，经NTSYSpc Version 2.10e软件分析，共获得153个两两比较的遗传相似系数，最大值为0.8457，最小值为0.5278。以0.65为阈值可以将18份土壤样品划分为6组，组I包括8份土壤样品。其中土壤样品1和样品2、样品3和样品4为直播1年生人参，4份土壤样品中的微生物种群遗传相似系数最高；样品7和样品8对应4（3+1）年生人参，由于经过人工移栽，在新土壤环境中实际仅生长了1年，他们与土壤样品1～样品4的遗传相似系数也较高。另外，该组还包括与土壤样品15和样品16对应的直播2年生西洋参。组II包括4份土壤样品，分别对应5（2+3）年生人参根际土、6（3+3）年生人参根际土、4（1+3）年生西洋参根际土和6（3+3）年生人参根围土。尽管4份土壤样品对应不同的人参种，生长年限也不相同，但仔细研究发现，他们均在新移栽土壤中生长了3年，其微生物种群结构也最接近。组III包括2份土壤样品，分别对应直播3年生西洋参根际土和直播3年生西洋参根围土。组IV仅有4（1+3）年生人参根围土1种。组V包括2份土壤样品，分别对应直播3年生人参根际土和直播3年生人参根围土。组VI也仅有5（2+3）年生人参根围土1种。从上述聚类结果不难发现，栽培年限对土壤中的微生物种群结构的影响最显著；其次，植物的种类对土壤微生物种群也有影响。尽管人参和西洋参同为五加科人参属植物，但从分类学的角度讲，他们属于不同的种，组III和组V中土壤微生物种群的遗传差异说明，即使是近缘植物，土壤微生物种群结构也可能存在差异。另外，根据相同参龄的人参（或西洋参）根际土和根围土聚类分析结果，寄主植物对土壤微生物种群结构的影响表现有根际效应。
　　
　　4 讨论
　　
　　目前，用于研究土壤微生物种群遗传多样性的分子生态学研究方法较多，如DGGE/TGGE、SSCP、T-RFLP、ARDRA等[19]。但是从研究技术自身特点而言，AFLP和RAPD的扩增条带最为丰富、引物的结合位点随机、能够对土壤微生物全基因组进行扫描，最适合开展土壤微生物种群研究。AFLP扩增结果稳定，可重复性高，结合高分辨力的聚丙烯酰胺凝胶电泳，能够对扩增产物进行高效分离，是研究土壤微生物种群遗传遗传多样性的首选。但该方法建立在限制性酶切的基础上，土壤微生物DNA提取物中的腐殖酸严重限制了该项技术在土壤微生态学研究中的应用[20]；另外，AFLP酶切时需要DNA模板的量较多（≥100 ng），如果微生物DNA提取量不够大，土壤中的非优势微生物种群将很难被发现[21]。尽管RAPD的扩增条带数量和可重复性均不如AFLP，但该方法对微生物DNA模板的质量和数量要求较低，在熟练掌握PCR扩增技术，严格控制反应条件和扩增体系的基础上，试验结果的稳定性能够得到保证[22]。
　　土壤微生物是土壤的重要组成部分，土壤微生物种群结构多样性与土壤养分循环、土壤微生态平衡、土壤理化性状保持等密切相关[23]。本研究尝试从土壤微生物种群遗传多样性变化的角度研究人参栽培过程中人参栽培土壤中微生物种群结构改变与土壤微生态环境恶化的关系。研究结果表明，不同栽培年限人参或西洋参根际土及根围土中的微生物种群结构均在显著差异，而且不同土壤样品中的微生物种群结构在一定程度上表现有根际效应。结合前期我们开展的人参根系分泌物对人参致病菌的化感效应研究，我们推测：人参或西洋参根系分泌物对其根际及根围土中的寄居的微生物形成定向选择压力，使得土壤微生物种群向着能够以人参或西洋参根系分泌物为碳（氮）源的方向发展，长期的定向选择压力使得人参或西洋参栽培地中的土壤微生物无法行使正常的土壤代谢功能，进而影响了重茬人参或西洋参的健康生长。为论证上述推测的合理性，笔者目前正在开展人参栽培过程中土壤微生物种群结构及生态功能变化的TGGE和BIOLOG分析，以求对上述推测提供佐证。