九乡新闻网邮编 英文:肝细胞核因子4α（HNF4α）诱导肝细胞功能的体外和体内研究
来源：百度文库 编辑：九乡新闻网 时间：2024/05/01 03:47:55
肝细胞核因子4诱导肝细胞功能的体外和体内研究
内容摘要目的：
首先比较不同肝细胞、胚胎干细胞embryonic stem cell，ES以及肝肿瘤细胞．HNF4α基因和肝细胞相关功能基因的表达情况，然后选择HNF4α作为外源目的基因，利用AdEasy
实验方法：
一、比较不同肝细胞、肝肿瘤细胞以及ES细胞HNF4α和肝细胞相关功能基因的表达RT-PCR检测人正常成熟肝细胞、人肝肿瘤细胞株以及人胎肝细胞株HNF4α基因和肝细胞相关功能基因的表达；同法检测小鼠正常成熟肝细胞、不同发育阶段胎肝细胞、小鼠ES细胞HNF4α基因和肝细胞相关功能基因的表达。
二、重组复制缺陷型腺病毒AdHNF4α构建及鉴定将pAdTrack-CMV与获得的HNF4α cDNA片段均经BglⅡ、EcoRⅤ酶切后连接，获得质粒pAdTrack-CMV-HNF4α，将Pme Ⅰ酶切线性化的pAdTrack-CMV-HNF4α与pAdEasy-1质粒共转化BJ5183感受态细菌同源重组，PacⅠ酶切筛选出pAdHNF4α，并测序验证目的基因序列的正确性。
PacⅠ酶切线性化的pAdHNF4α转染293细胞，反复感染、冻融293细胞，获得AdHNF4α，以同样方法获得对照病毒AdGFP。
将AdHNF4α体外感染胎肝细胞株L02，以RT-PCR和Western blot检测HNF4α在肝细胞中的表达。
三、外源导入HNF4α对人肝肿瘤细胞生物学特性影响人肝肿瘤细胞株HepG2和Hep3B均以5×10<5>/皿接种于六孔板，分别将病毒以感染复数multiplicity of infection，MOI40、50感染细胞，24 h后更换含10%胎牛血清的新鲜DMEM培液，3 d后观察GFP表达，RT-PCR和Western blot检测HNF4α表达，RT-PCR检测肝细胞相关功能基因的表达，流式细胞仪测定肝肿瘤细胞凋亡率。
四、外源导入HNF4α对小鼠ES细胞生物学特性影响首先制备小鼠原代胚胎成纤维细胞primary mouse embryonic fibroblast，PMEF滋养层，将小鼠ES细胞接种于其上进行培养和传代；将ES细胞以密度为2x10<5>/ml接种于培养皿中悬浮培养，第5 d将形成的胚体以30～40个/皿接种于0.1%明胶包被过的35 mm组织培养皿使其贴壁诱导分化，培养液中分别加入AdHNF4α或对照病毒AdGFP，在分化过程中观察GFP，并添加病毒维持HNF4α表达，免疫细胞化学法检测CK8、CK18、AFP以及ALB的表达，RT-PCR检测肝细胞相关功能基因的表达，过碘酸-Schiff氏法Periodic Acid-Shift，PAS法检测糖原合成，吲哚氰绿Indocyanine Green，ICG吸收染色实验检测细胞代谢ICG功能。
五、HNF4α基因修饰的移植肝细胞治疗小鼠急性肝功能衰竭将HNF4α基因修饰的HepG2HepG2-HNF4α以4×10<6>/只通过尾静脉导入CCl<,4>诱导的急性肝功能衰竭小鼠体内，通过检测小鼠血清总胆红素和血糖，观察小鼠的一般情况和生存率等指标，评估HNF4α基因修饰的HepG2对实验性急性肝功能衰竭的治疗效果。
六、统计学处理数据采用SPSS12.0统计软件包进行分析，灰度比值采用One-Way ANOVA分析，方差非齐性则采用非参数检验；P<0.05为具有显著性差异，P<0.01为具有非常显著性差异。
实验结果：
一、在不同分化水平的肝细胞中HNF4α表达有明显差异。
1.RT-PCR检测人正常成熟肝细胞、人肝肿瘤细胞株Huh-7、Hep3B、HepG2、人胎肝细胞株L02以及WRL-68的HNF4α基因和肝细胞相关功能基因的表达情况，结果显示在不同分化水平的肝细胞中HNF4α表达有明显差异，在正常成熟的肝细胞中表达最高，其表达量约为肝肿瘤细胞株Huh-7表达量的4倍、Hep3B表达量的10倍以及HepG2表达量的2.3倍P<0.05，而在永生化的胚胎肝细胞株L02和WRL-68中无明显表达；同时肝细胞的重要功能基因如载脂蛋白CⅢapolipoprotein cⅢ，APOCⅢ、葡萄糖-6-磷酸酶glucose-6-phosphatase，G-6-P、白蛋白albumin，ALB、谷胺酰氨合成酶glutaminesynthetase，GS、细胞色素P450家族1α2cytochrome P450 1α2，CYP1α2、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK以及甲状腺激素结合蛋白transthyretin，TTR的表达与HNF4α基因的表达密切相关，这些基因在成熟肝细胞中的表达较肝肿瘤细胞株明显增多，而胚胎肝细胞株中未见明显表达。
2.RT-PCR比较小鼠正常成熟肝细胞、ES细胞、胚龄13 d胎肝细胞、胚龄15 d胎肝细胞、胚龄19 d胎肝细胞和出生后1 d小鼠胎肝细胞的HNF4α以及肝细胞相关功能基因的表达情况，结果显示：
随着分化水平的提高，HNF4α表达逐渐增加，同时肝细胞相关的重要功能基因如CYP1α2、ALB、G-6-P、苯丙氨酸羟化酶phenylalanine hydroxylase，PAH、PEPCK、TTR以及GS等表达也相应逐渐上调。
二、AdHNF4α的构建及鉴定。
通过PCR扩增获得1425 bp人HNF4α cDNA片段，测序鉴定并作同源序列分析加以证实；体外连接获得穿梭质粒pAdTrack-CMV-HNF4α，同源重组后筛选获得pAdHNF4α；经293细胞包装并反复感染、冻融，获得1×10<10>表达形成单位/mlefu/ml滴度的AdHNF4α；AdHNF4α体外感染肝细胞株L02 3 d后，RT-PCR和Western blot检测HNF4α在转录和翻译水平上的表达均明显增强，证实病毒构建成功并能在细胞内维持HNF4α高效表达。
三、外源导入HNF4α基因对人肝肿瘤细胞生物学特性的影响。
1.将AdHNF4α以MOI 40、50分别感染细胞HepG2和Hep3B 3 d后，荧光显微镜下可见90%以上的细胞表达GFP；RT-PCR与Western blot均检测出HNF4α在肿瘤细胞中表达明显上调。
2.RT-PCR显示，导入HNF4α基因明显提高肝肿瘤细胞CYP1 α 2、G-6-P、GS、PEPCK以及APOCⅢ等肝细胞相关功能基因mRNA表达，其中G-6-PmRNA表达上调近50倍，而ALB、TTR表达未见明显变化，AFP表达则明显下调。
3.流式细胞仪结果表明：
上调肝肿瘤细胞HNF4α表达后细胞的凋亡率分别增加约3.0倍Hep3B中AdGFP组凋亡率10.1%，AdHNF4α组29.8%，P<0.05和4.5倍HepG2中AdGFP组凋亡率6.5%，AdHNF4α组29.2%，P<0.05。
四、外源导入HNF4α对小鼠ES细胞生物学特性影响。
1.将小鼠ES细胞株ES-D3复苏后接种于铺有MEF滋养层细胞的组织培养皿中，每天换液，2～3 d可见到表面光滑、边界清楚的细胞克隆，悬浮培养形成胚体。
2.将第5 d的胚体接种于0.1%明胶包被过的组织培养皿，使其贴壁诱导分化，并在培养液中加入AdHNF4α感染3 d后，荧光显微镜下可见克隆周边分化的细胞90%以上均表达GFP； RT-PCR与免疫细胞化学法均检测出HNF4α在小鼠ES细胞的表达较对照组明显上调，HNF4α蛋白主要表达于细胞核内。
3.免疫细胞化学法显示，AdHNF4α感染实验组细胞早在第8 d即有CK8、CK18以及AFP大量表达，且较对照组阴性对照组和AdGFP感染组明显增强；感染组细胞ALB于第15 d开始表达，较对照组显著增加。
结论:1.HNF4α表达与肝细胞分化水平明显相关。
随着分化水平的提高，其表达逐渐增加，在正常成熟的肝细胞中表达最高，同时肝细胞生物学功能基因表达水平与HNF4α的表达密切相关。
2.利用AdEasy
3．通过上调小鼠ES细胞HNF4α表达，可明显提高正常肝细胞如CYP1α2、G-6-P、PAH以及ALB等功能基因的表达，糖原合成和ICG代谢功能显著增强，ES细胞向肝细胞定向分化的能力明显提高。
4．利用HNF4α基因修饰的HepG2移植治疗急性肝功能衰竭小鼠可明显提高动物模型的生存率，有效改善肝功能。
5．HNF4α基因修饰肝细胞有望成为治疗急性肝功能衰竭的有效工具..……
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