重生之修仙在军营:整合素αvβ3受体靶向的MR分子探针制备及体外成像

【摘要】  目的： 构建结缔组织生长因子多肽(CTGFP)超微超顺磁氧化铁粒子(USPIOs)磁共振(MR)分子探针,以显示高表达整合素αvβ3受体人肝癌Bel7402细胞。方法：用免疫细胞化学方法检测Bel7402细胞αvβ3受体表达情况；用邻苯二马来酰亚胺(OPDM)将USPIO和CTGFP偶联；将USPIOCTGFP、USPIO分别与Bel7402细胞孵育,同时设立多肽竞争组及对照组,行普鲁士蓝染色显示铁颗粒,体外磁共振成像(MRI)观察在T2WI上T2弛豫时间变化。结果： Bel7402细胞αvβ3受体表达阳性；普鲁士蓝染色可见USPIOCTGFP组铁颗粒分布在细胞膜,而USPIO组及竞争组细胞膜上和细胞内铁颗粒极少；体外MRI显示USPIOCTGFP组T2弛豫时间低于USPIO组、竞争组及对照组(P＜0.05)。结论： USPIOCTGFP对αvβ3受体具有较好靶向作用,可通过MRI显示高表达整合素αvβ3受体Bel7402细胞。

【关键词】  结缔组织生长因子　多肽　分子影像学　分子探针　超微超顺磁氧化铁粒子

　　Preparation of MR molecular probe targeting integrin　αvβ3 receptor and its in vitro imaging

　　WANG Xiaodong，WU Guoqiu，JU Shenghong，TENG Gaojun，YAO Yuyu，LIU Naifeng
   
　　1. Department of Cardiology，Zhongda Hospital，Southeast University，Nanjing  210009，China；2. Ｄepartment of Laboratory，Zhongda Hospital，Southeast University，Nanjing  210009，China；3.　Department of Radiology,Zhongda Hospital，Southeast University，Nanjing  210009，China
   
  　  Abstract： Objective  To synthesize a novel MR molecular probe of ultra superparamagnetic iron oxide particles (USPIOs) containing connective tissue growth factor peptide (CTGFP) and to display integrin αvβ3 receptor highly expressed on human hepatic carcinoma cells (Bel7402 cells).Methods  The expression of integrin αvβ3 receptor on Bel7402 cells was detected by immuocytochemistry.The CTGFP and USPIOs were conjugated by N，N’Ophenylenedimaleimide (OPDM).The Bel7402 cells were incubated with USPIOCTGFP and USPIOs respectively.Meanwhile，the competition experiments and the control experiments were performed.Prussian blue staining was conducted to show iron.Magnetic resonance imaging (MRI) was performed to observe the T2 relaxation time by using T2WI sequence.Results  The results of immuocytochemistry showed that integrin αvβ3 receptor was positively expressed on Bel7402 cells.The prussian blue staining revealed that there was large amounts of iron binding with integrin αvβ3 receptor in Bel7402 cells，while there was little iron in the USPIO group and the competion group.T2 relaxation time of cells treated with USPIOCTGFP was shorter (P＜0.05)than that of others.Conclusion  The MR molecular probe，USPIOCTGFP,can effectively target integrin αvβ3 receptor and can be applied to display integrin αvβ3 receptor expressed on Bel7402 cells．
   
　　Key words：connective tissue growth factor；　peptide；molecular imaging；　molecular probes；　ultra superparamagnetic iron oxide particles

　　近年来,分子影像学已成为研究的热点,它将分子生物学、药物化学和现代医学影像学密切结合,在细胞和分子水平对生物学过程进行活体定性及测量［1］。分子影像技术的关键在于运用高特异性成像专用探针、相应的放大技术和敏感高效的图像检出系统。磁共振成像(MRI)由于其极强的成像能力及广泛的应用前景而受到关注,多种MR分子探针的开发成果也不断出现［23］。

    　整合素αvβ3受体在新生血管内皮细胞和一些肿瘤组织高表达,而正常组织不表达或低表达此受体［4］。结缔组织生长因子多肽(connective tissue growth factor peptide,CTGFP)是一个人工合成的16肽,来源于结缔组织生长因子第4结构域，可以特异性与αvβ3受体结合（专利申请号：2009１００２５７３１.0）。研究表明,CTGFP与CTGF二者都可与NRK52E细胞结合,但CTGFP与该细胞结合后不产生致纤维化作用,具有潜在抗纤维化用途［5］。

    　本研究通过构建含该多肽的分子探针,特异性结合高表达αvβ3受体的肿瘤细胞,为在体肿瘤显像和在体药物靶向投递系统的研究打下基础。

　　1  材料和方法

 　   1.1 材料

  　  超微超顺磁氧化铁粒子（USPIOs，东南大学生物科学与医学工程学院惠赠),人肝癌细胞株Bel7402细胞(中国药科大学生命科学学院新药研发中心提供),CTGFP（上海生工生物工程技术服务有限公司合成),胎牛血清(杭州四季青公司),RPMI 1640(Gibco公司),抗人αvβ3抗体(R & D公司),SP试剂盒及DAB显色剂(北京中杉金桥生物技术有限公司),荧光倒置相差显微镜(日本Nikon公司),7.0 T微型MR仪(德国Bruker公司)。

   　 1.2  方法

　　1.2.1  探针构建 

　　将0.1 mg USPIOs 用0.9 ml 0.1 mol·L-1 pH 5.0醋酸钠缓冲液悬浮,加入0.1 ml 0.2 mol·L-1 2巯基乙醇37 ℃反应90 min。将上述溶液通过离心法(6 000 r·min-1)用0.01 mol·L-1 pH 7.2 PBS洗涤3次,用0.75 mmol·L-1 OPDM醋酸钠缓冲液500 μl重新悬浮,30 ℃反应20 min,PBS洗涤3次后,加入500 μl 0.4 mg·ml-1 CTGFPPBS溶液30 ℃反应20 min。用0.1 mol·L-1的NaOH将上述溶液pH调至7.0后置于4 ℃ 24 h，PBS洗涤3次后用2% BSAPBS 4 ℃过夜，PBS洗涤3次后用0.01% BSAPBS 4 ℃ 保存。

　　1.2.2 细胞培养和实验分组 

　　Bel7402 细胞采用含10％胎牛血清、100 U·ml-1青霉素钠、100 U·ml-1链霉素的 RPMI 1640培养液,在37 ℃、5％CO2 饱和湿度的条件下传代培养。将细胞传代后用6孔板或培养瓶培养,分成USPIOCTGFP组、ＵＳＰＩＯ组、竞争组及对照组4组,每组3个复孔,分别用USPIOCTGFP(20 μg·ml-1)、USPIO(20 μg·ml-1)、CTGFP(2 mg·ml-1,预孵育30 min)加USPIO(20 μg·ml-1)及生理盐水孵育1 h 后行普鲁士蓝染色和MRI检查。

　　1.2.3 免疫细胞化学检测 

　　用链霉卵白素过氧化物酶检测法,染色步骤严格按照试剂盒说明书进行,阴性对照以PBS代替一抗。

　　1.2.4 普鲁士蓝染色 

　　将细胞用PBS洗涤3次,用4％多聚甲醛固定20 min,普鲁士蓝反应液(等体积20％ 盐酸水溶液与10％亚铁氰化钾临时混合)孵育30 min,蒸馏水洗涤3次,0.5％中性红复染3 min,再蒸馏水洗涤3次,最后在荧光倒置相差显微镜下观察铁染色情况。

　　1.2.5 体外MRI 

　　将细胞用PBS洗涤3次,0.25％胰蛋白酶消化液消化,PBS洗涤并重悬于10%凝胶中,置于1.5 ml Ependof 管中行MR扫描。采用多层多回波序列,TR 1 000 ms,TE 100 ms,层厚1.5 mm,FOV 3.5 cm,atrix=256×256,用T2 map 人工画感兴趣区，计算T2弛豫时间。

    1.3 统计学处理

   　 应用 SPSS 16.0软件包进行统计,计量数据用±s表示,T2 弛豫时间各组间的比较采用多组独立样本的单因素方差分析,双侧检验,P＜0.05表示差异具有统计学意义。

  　  2  结 果

 　   2.1  探针构建结果

   　 分子探针合成后有少量胶体形成,稍浑浊。

    　2.2 整合素αvβ3受体表达情况

  　  免疫细胞化学检测显示,人肝癌Bel7402细胞出现较强的整合素αvβ3受体免疫染色,在细胞膜和细胞质均有分布；对照组未见免疫染色(图1)。

  　  2.3 普鲁士蓝染色

   　 USPIOCTGFP与Bel7402细胞孵育后,胞膜上可见较多蓝色颗粒；未修饰USPIO与Bel7402细胞孵育后,细胞膜上及细胞内几乎未见蓝色颗粒；竞争组细胞膜上可见少量蓝色颗粒；对照组细胞膜上及膜内外均未见蓝色颗粒(图2)。

   　 体外MRI示USPIOCTGFP与Bel7402细胞孵育后的MR信号在T2WI上较USPIO组明显降低,而竞争组MR信号在T2WI上较USPIO组稍降低(图3)。对照组T2弛豫时间为(149.09±7.00)ms，20 μg·ml-1铁浓度的USPIOCTGFP与Bel7402细胞孵育后T2弛豫时间下降至(96.48±3.88)ms， USPIO组和竞争组的T2弛豫时间无明显下降(图4)，USPIOCTGFP组的T2弛豫时间与其他3组相比差异具有统计学意义(P＜0.05)。

　　3 讨 论

   　 分子影像技术目前研究较多的是单克隆抗体或人源化抗体修饰的分子探针,二者有较强的免疫原性和种属选择性,且制备较复杂。多肽是近年来小分子探针颇受重视的一个研究方向,与抗体相比,其相对分子质量小,易穿透细胞,免疫原性弱,制备简便,具有较高的研究和应用价值［6］。RGD 肽是一种含有精氨酸(arginine)、甘氨酸(glycine)和天冬氨酸(aspartic acid)序列的小肽,是整合素αvβ3 受体的特异性识别序列［7］。基于 RGD/αvβ3 的靶向投递系统分子成像在动脉粥样硬化和肿瘤的应用已有较多报道［89］。我们的前期研究表明,本实验所用的多肽可以和整合素αvβ3受体特异性结合,且氨基酸序列对比结果显示不含RGD序列,因此本实验首次探讨了非RGD介导的αvβ3受体靶向投递系统用于分子成像的可行性,并评价其效果。

  　  细胞高表达靶分子是分子成像的基础,免疫细胞化学染色可以用来检测微量抗原在细胞和亚细胞的定位。本研究通过免疫细胞化学检测到Bel7402细胞αvβ3受体表达阳性,故Bel7402细胞可用于USPIOCTGFP的靶向性检测和体外MRI。

   　 分子探针的构建是分子成像的关键技术。USPIO以其自身的优点,如直径小、半衰期长、易于在细胞间通透移动［10］而适用于带有特定分子的细胞组织显像,因此本研究选择USPIO作为显像剂。作者用双功能偶联剂OPDM通过形成2个稳定的胱硫醚基团实现多肽和USPIO的定向偶联。OPDM法偶联效率高,形成的偶联物多肽或蛋白质的生物活性损失较少,是构建分子探针的理想选择［11］。

    　评价药物靶向投递系统的一个重要研究内容是分子探针对其病变部位的选择性,即靶向性。靶向性使药物在活性部位有更高的浓度,从而降低药物剂量,减少毒副反应。本研究建立的CTGFPαvβ3投递系统,运用了配体受体相识别、结合的原理,将CTGFP与纳米粒子偶联,从而将USPIOCTGFP的选择性导向αvβ3受体阳性的Bel7402细胞。普鲁士蓝染色结果显示Bel7402细胞与USPIOCTGFP的结合明显多于USPIO,且Bel7402细胞与游离多肽预孵育后,细胞与USPIOCTGFP的结合显著减少，可以推论CTGFP修饰的纳米粒子大大改善了细胞与纳米粒子的结合,修饰多肽后使纳米粒子获得了选择性,实现了CTGFP/αvβ3投递系统的靶向作用。

   　 MRI以其高分辨率、高对比性而成为目前分子影像学常用的成像技术。本实验所用的微小MR仪场强为7 T,它的信噪比和空间分辨力较一般的MR仪显著提高。靶细胞经MR对比剂标记后,可以更易被MR检测。本实验将USPIO和CTGFP通过化学合成法偶联,利用其USPIO T2阴性对比剂效应,在体外细胞水平对CTGFP/αvβ3投递系统进行检测。体外MRI研究结果显示,USPIOCTGFP与Bel7402细胞孵育后,与未修饰的纳米粒子组相比T2弛豫时间下降29.6%,提示可用7.0TMR仪进行临床检测,且推测其因靶向性良好,故对靶目标的检测敏感性较USPIOs高。

   　 综上所述,本实验制备了非RGD介导的αvβ3受体靶向纳米粒子,并通过配体受体相结合的原理,用普鲁士蓝染色观察构建的分子探针对αvβ3受体靶向性,最后探索了该分子探针用于7.0TMR仪体外细胞水平成像的效果。结果表明，该分子探针对高表达整合素αvβ3受体的Bel7402细胞有良好的靶向性,可用MR仪进行检测。但该分子探针的物理性质,及用于MRI的最佳浓度和最佳作用时间尚待进一步研究。

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