九乡新闻网魔剑侠情 电影:过氧化脂质测定
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发布时间:2008-12-5 查看151次
过氧化脂质（lipoperoxides，LPO）是自由基使脂质发生过氧化作用而形成的。它使生物体内细胞膜发生过氧化作用而受到损伤，使体内重要脏器及血管都受害导致疾病和老化。脂质过氧化反应可形成丙二醛、乙烷、共轭二烯、荧光产物和一些能发光的产物，测定这些产物的变化，就能表明过氧化反应的变化。因此，该类方法，对开发有效的抑制体内自由基的药物十分重要。
1、血清中过氧化脂质测定
（1）TBA荧光测定法 LPO随蛋白沉淀后，沉淀物在酸性环境下膜脂质过氧化而产生丙二醛（malondialdehyde，MDA）与TBA缩合后形成复合物，这种复合物具有高灵敏荧光特性。从而可用荧光分光光度计来进行测定。
材料与试剂：
①TEP标准溶液。准确吸取四乙氧基丙烷100ml，加甲醇至50ml，含量为8mmol/L，4℃保存期为一个月。用时以双蒸水稀释成8μmol/L TEP标准应用液。
②20mmol/L TBA溶液。称取576.6mg TBA溶于80ml水中，60℃以下加热助溶，稀释至100ml，再与冰醋酸等量混合。
③甲醇。
④荧光分光光度计及记录仪。
方法：
①取3支10ml带塞玻璃试管，分别为测定管、标准管和空白管，测定管加血清20μl，标准管加TEP标准应用液20μl，空白管加水20μl。
②各管依次加水2ml，TBA溶液1ml混匀，100℃加热60min。
③用流动水冷却，各加甲醇1ml，充分混匀后，用3000r/min，离心10min。
④上清以Ex515mn，Em550nm测定各管荧光强度（F），按下式计算出LPO含量。
血清LOP含量（μmol/L）=（F测定-F空白）/（F标准-F空白）×8
本法具有灵敏度高，特异性好、方法快速等优点；对实验用水的纯度和玻璃仪器的清洁度要求较高，实验用水需为双蒸水，玻璃仪器需经50%的硝酸除荧光，否则，空白值较高，干扰测定。
（2）反相高效液相色谱荧光法测定血清中LPO
材料与试剂：
①TEP标准贮备液（0.01mol/L）。称取0.1102g四乙氧基乙烷，以水稀释至50ml，4℃保存，测定使用液（150nmol/L）用其稀释而成。
②TBA溶液（0.5%）（硫代巴比妥酸）。称取0.5g TBA，加入约60ml水以低于60℃加热溶解，冷却至20℃，以水配至100ml。
③H3PO4溶液（0.15mol/L）。取1ml H3PO4（含量85%）以水稀释至100ml。
实验中所用均为分析纯试剂和双蒸水。
④微量高压平流泵；荧光检测器；恒温水浴槽；旋涡混合器。
⑤色谱条件。色谱柱：直径4.6mm×200mm 7μ Nacleosil次开发C13柱；
流动相：甲醇+磷酸盐缓冲液（0.025mol/L，pH6.5）十四丁基溴化铵（0.5mol/L）=68∶32∶2（体积比）使用前以0.45μm滤膜真空抽滤；
光源设定Ex526，Em553；
流量：1.0ml/min；
进样管体积：30ml
方法：
①取血清50ml，加入0.25ml TBA溶液，0.70ml H3PO4溶液，混匀后置95℃水浴中35min。
②水流冷却至室温，再称出0.50ml至另一试管内，加入0.50ml甲醇，混合30s。
③4000r/min，10min离心，取上清进样测定。
本法为外标法定量，样品与标准品在用时处理为好。此外，为减少误差，定量以采用测定波峰面积为好。
2、组织中过氧化脂质测定
材料与试剂：
①TBA试剂。0.8% TBA水溶液。称取0.8g TBA，用双蒸水配成100ml，50℃水浴或室温下溶解，静置，用上清液。
②标准贮备液。10μmol/L四乙氧基丙烷的甲醇溶液。准确称取1，1，3，3-四乙氧基丙烷110mg，以甲醇定容至50ml。
③标准应用液。10nmol/ml四乙氧基丙烷。吸取贮备液0.1ml，以甲醇稀释成100ml。
④8.1% SDS。
⑤20%醋酸盐缓冲液，pH3.5。
⑥正丁醇吡啶混合液，按体积比15∶1混合。
⑦生理盐水。
方法：
①取出肝组织，用冷生理盐水灌流脱血后，制成10%的匀浆液。
②吸取10%的匀浆液0.1ml（以生理盐水代替样品和为空白对照），加入8.1% SDS 0。2ml、20%醋酸盐缓冲液1.5ml、0.8% TBA水溶液1.5ml、双蒸水0.7ml。
③盖上塞子，95℃，准确水浴1h。
④取出，用流动水冷却至室温。
⑤加入双蒸水1.0ml、正丁醇吡啶液5.0ml。
⑥振荡，抽提1min。
⑦3000g离心15min，以使溶液分层。
⑧吸取上层（正丁醇吡啶层），设定Ex515，Em553，测定各管荧光强度。
⑨以不同浓度的MDA标准液代替样品，制作标准曲线。
注意：
①当组织中过氧化脂质含量太低，胆红素量又很高或者试样量太小时，也可像血液样品一样进行荧光测定。
②当最后离心后的上清出现混浊时，可加一滴无水乙醇。
过氧化脂质（lipoperoxides，LPO）是自由基使脂质发生过氧化作用而形成的。它使生物体内细胞膜发生过氧化作用而受到损伤，使体内重要脏器及血管都受害导致疾病和老化。脂质过氧化反应可形成丙二醛、乙烷、共轭二烯、荧光产物和一些能发光的产物，测定这些产物的变化，就能表明过氧化反应的变化。因此，该类方法，对开发有效的抑制体内自由基的药物十分重要。
1、血清中过氧化脂质测定
（1）TBA荧光测定法 LPO随蛋白沉淀后，沉淀物在酸性环境下膜脂质过氧化而产生丙二醛（malondialdehyde，MDA）与TBA缩合后形成复合物，这种复合物具有高灵敏荧光特性。从而可用荧光分光光度计来进行测定。
材料与试剂：
①TEP标准溶液。准确吸取四乙氧基丙烷100ml，加甲醇至50ml，含量为8mmol/L，4℃保存期为一个月。用时以双蒸水稀释成8μmol/L TEP标准应用液。
②20mmol/L TBA溶液。称取576.6mg TBA溶于80ml水中，60℃以下加热助溶，稀释至100ml，再与冰醋酸等量混合。
③甲醇。
④荧光分光光度计及记录仪。
方法：
①取3支10ml带塞玻璃试管，分别为测定管、标准管和空白管，测定管加血清20μl，标准管加TEP标准应用液20μl，空白管加水20μl。
②各管依次加水2ml，TBA溶液1ml混匀，100℃加热60min。
③用流动水冷却，各加甲醇1ml，充分混匀后，用3000r/min，离心10min。
④上清以Ex515mn，Em550nm测定各管荧光强度（F），按下式计算出LPO含量。
血清LOP含量（μmol/L）=（F测定-F空白）/（F标准-F空白）×8
本法具有灵敏度高，特异性好、方法快速等优点；对实验用水的纯度和玻璃仪器的清洁度要求较高，实验用水需为双蒸水，玻璃仪器需经50%的硝酸除荧光，否则，空白值较高，干扰测定。
（2）反相高效液相色谱荧光法测定血清中LPO
材料与试剂：
①TEP标准贮备液（0.01mol/L）。称取0.1102g四乙氧基乙烷，以水稀释至50ml，4℃保存，测定使用液（150nmol/L）用其稀释而成。
②TBA溶液（0.5%）（硫代巴比妥酸）。称取0.5g TBA，加入约60ml水以低于60℃加热溶解，冷却至20℃，以水配至100ml。
③H3PO4溶液（0.15mol/L）。取1ml H3PO4（含量85%）以水稀释至100ml。
实验中所用均为分析纯试剂和双蒸水。
④微量高压平流泵；荧光检测器；恒温水浴槽；旋涡混合器。
⑤色谱条件。色谱柱：直径4.6mm×200mm 7μ Nacleosil次开发C13柱；
流动相：甲醇+磷酸盐缓冲液（0.025mol/L，pH6.5）十四丁基溴化铵（0.5mol/L）=68∶32∶2（体积比）使用前以0.45μm滤膜真空抽滤；
光源设定Ex526，Em553；
流量：1.0ml/min；
进样管体积：30ml
方法：
①取血清50ml，加入0.25ml TBA溶液，0.70ml H3PO4溶液，混匀后置95℃水浴中35min。
②水流冷却至室温，再称出0.50ml至另一试管内，加入0.50ml甲醇，混合30s。
③4000r/min，10min离心，取上清进样测定。
本法为外标法定量，样品与标准品在用时处理为好。此外，为减少误差，定量以采用测定波峰面积为好。
2、组织中过氧化脂质测定
材料与试剂：
①TBA试剂。0.8% TBA水溶液。称取0.8g TBA，用双蒸水配成100ml，50℃水浴或室温下溶解，静置，用上清液。
②标准贮备液。10μmol/L四乙氧基丙烷的甲醇溶液。准确称取1，1，3，3-四乙氧基丙烷110mg，以甲醇定容至50ml。
③标准应用液。10nmol/ml四乙氧基丙烷。吸取贮备液0.1ml，以甲醇稀释成100ml。
④8.1% SDS。
⑤20%醋酸盐缓冲液，pH3.5。
⑥正丁醇吡啶混合液，按体积比15∶1混合。
⑦生理盐水。
方法：
①取出肝组织，用冷生理盐水灌流脱血后，制成10%的匀浆液。
②吸取10%的匀浆液0.1ml（以生理盐水代替样品和为空白对照），加入8.1% SDS 0。2ml、20%醋酸盐缓冲液1.5ml、0.8% TBA水溶液1.5ml、双蒸水0.7ml。
③盖上塞子，95℃，准确水浴1h。
④取出，用流动水冷却至室温。
⑤加入双蒸水1.0ml、正丁醇吡啶液5.0ml。
⑥振荡，抽提1min。
⑦3000g离心15min，以使溶液分层。
⑧吸取上层（正丁醇吡啶层），设定Ex515，Em553，测定各管荧光强度。
⑨以不同浓度的MDA标准液代替样品，制作标准曲线。
注意：
①当组织中过氧化脂质含量太低，胆红素量又很高或者试样量太小时，也可像血液样品一样进行荧光测定。
②当最后离心后的上清出现混浊时，可加一滴无水乙醇。