九乡新闻网蓝色大门主题:引物设计
来源：百度文库 编辑：九乡新闻网 时间：2024/04/27 21:35:30
1、引物长度至少16bp，常用的是18-30bp，进行长片段PCR时引物长度应增加到30-35，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，即Taq酶的最适温度。
2、引物的Tm值一般控制在55-60度, 尽可能保证上下游引物的Tm值一致，一般差异最好在2-5度. 保证两个引物正确退火。如果引物中的G+C含量相对偏低,则可以使引物长度稍长,而保证一定的退火温度。Tm=2(A+T)+4(C+G)。
3、尽可能选择碱基随机分布的序列，避免具有多聚嘌呤、多聚嘧啶，以及T在3’末端的重复排列。有效引物中(G+C)的比例为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。
4、每条引物内部应避免具有明显的引物二级结构（发卡结构，发卡柄至少4个碱基对，发卡环至少有3个碱基），尤其避免在3’端出现。引物之间不应有互补序列，尤其是3’端的互补碱基，不能多于5个，否则会引起引物二聚体。
5、引物的3’末端最好是G或C，但不要GC连排。
6、引物浓度习惯为终浓度是1 uM。
7、引物要能包含整个ORF，要设计上酶切位点，还要有原基因的RBS，注意在连接到表达载体时一定要保证阅读框的正确性。
2、引物的Tm值一般控制在55-60度, 尽可能保证上下游引物的Tm值一致，一般差异最好在2-5度. 保证两个引物正确退火。如果引物中的G+C含量相对偏低,则可以使引物长度稍长,而保证一定的退火温度。Tm=2(A+T)+4(C+G)。
3、尽可能选择碱基随机分布的序列，避免具有多聚嘌呤、多聚嘧啶，以及T在3’末端的重复排列。有效引物中(G+C)的比例为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。
4、每条引物内部应避免具有明显的引物二级结构（发卡结构，发卡柄至少4个碱基对，发卡环至少有3个碱基），尤其避免在3’端出现。引物之间不应有互补序列，尤其是3’端的互补碱基，不能多于5个，否则会引起引物二聚体。
5、引物的3’末端最好是G或C，但不要GC连排。
6、引物浓度习惯为终浓度是1 uM。
7、引物要能包含整个ORF，要设计上酶切位点，还要有原基因的RBS，注意在连接到表达载体时一定要保证阅读框的正确性。