静电喷枪:非特异性染色的消除方法(免疫荧光和免疫组化)

来源:百度文库 编辑:九乡新闻网 时间:2024/03/29 22:41:38
免疫荧光非特异性染色的消除方法
(一)非特异性染色的主要因素
组织的非特异性染色的机理很复杂,其产生的原因主要可分以下几点:
1.一部分荧光素未与抗体结合,形成了聚合物和衍化物,而不能被透析除去引起非特异性染色。
2.抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白,可与组织成分非特异结合。
3.除去检查的抗原以外,组织中还可能存在类属抗原(如Forssman氏抗原),可与组织中特异性抗原以外的相应抗原结合。
4.从组织中难以提纯抗原性物质,所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体,以致容易混淆。
5.抗体分子上标记的荧光素分子太多,这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子,可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。
6.荧光素不纯,标本固定不当等。
(二)消除非特异性染色的方法
消除荧光抗体非特异性染色的方法应根据产生的原因采取适当的方法,常用的方法有以下几种:
1.透析法
荧光素如FITC分子可以通过半透膜,而蛋白质大分子不能透过,可将未与蛋白结合的荧光素透析除去。
(1)将标记完毕的荧光抗体液装入一透析袋或玻璃纸袋内,液面稍留空隙,紧扎。
(2)浸人0.01mol/L pH7.2的PBS中(悬于大于标记物体积约50—100倍的PBS内),在4℃中透析,每日更换3~4次PBS,透析液中无荧光即可(在荧光光源照射下)。
2.葡聚糖凝胶G-50柱层析法
除去游离荧光素可用葡聚糖凝胶G-25或G-50柱层析方法,加入荧光抗体15~18ml(按床体积的5%~10%加样),使其缓慢渗人柱内,待即将全部入柱时,加入PBS少许,关闭下口,停留30—40min,使游离荧光素充分进入分子筛孔中,然后再接通洗脱瓶开始滴入洗脱液。加入洗脱液一定量后,荧光抗体即向下移行,逐渐与存留于上端的游离荧光素之间拉开明显的距离界线,随着大量洗脱液的不断加入,二者分离距离越来越大,荧光抗体最先流出,分前、中、后三部分,收集中间部分,测F/P比值,合格者浓缩,分装。如仅用小量荧光抗体,可用1cm×20cm的层析柱,取2g Sephadex G-50装柱,即可过滤2~3.5ml荧光抗体。
3. 荧光抗体稀释法
先测定荧光抗体的特异性染色与非特异性染色效价,若二者效价相差较大,则可将荧光抗体稀释至一临界浓度,使特异性染色呈阳性,而使非特异性染色保持阴性,稀释方法和染色效价测定方法相同。
4. 纯化抗原方法
用各种方法提纯单一成分的抗原是产生单价特异性抗体的最主要条件。现代免疫化学技术(免疫吸收法)和柱层析法等提供了很大的可能性。
5.伊文蓝(Evan blue)衬染色方法
用0.01%伊文蓝的0.01mol/L pH7.2 PBS溶液稀释荧光抗体,可将背景细胞和组织染色呈红色荧光,与特异性黄绿色荧光形成鲜明的对比,减少了非特异性荧光,宜作常规应用。伊文蓝一般配成1%溶液,保存于4℃,用前再稀释至0.01%用以稀释荧光抗体。
此外,还可以用胰酶消化组织切片或用10%牛血清蛋白封闭法等消除非特异性染色,提高特异性染色。

免疫组化非特异性染色的消除方法:
(1)缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。这是最重要的一条。
(2)一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色,建议试用单克隆抗体看看。但是单克隆的一般都几千元一个抗体,价格比较贵,不过结果会很好,尤其是背景一般不会太深。
(3)DAB显色时间如何把握?
DAB显色时间不是固定的,主要由显微镜下控制显色时间,到出现浅棕色本底时即可冲洗;
DAB显色时间很短(如几秒或几十秒)就出现很深的棕褐色,这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长,需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间;
此外,若很短时间就出现背景很深,还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全,需要延长封闭时间;
DAB显色时间很长(如超过十几分钟)才出现阳性染色,一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短(最好一抗4度过夜);另一方面就是封闭时间过长。
非特异性染色的原因
1. Ig与Fc受体结合
多见于冰冻切片(特别是淋巴造血组织,淋巴细胞,单核细胞,组织细胞表面多),主要是和二抗反应,因为一抗一般稀释度均较大,因此Fc受体的干扰基本不存在。由于福尔马林固定破坏了大部分的Fc受体,所以石蜡切片不多见。
避免方法:
① 用以二抗相同种族的正常血清封闭切片;
② 用不含Fc段的抗体,但价格贵
(V区,C1区不含Fc段,用Pepsin消化)

2.静电吸附
抗体是一种带负电荷的球蛋白,容易和带正电荷的组织相结合,如胶原纤维。

避免方法:
① 尽量稀释一抗
② 降低抗体的电荷,如用2.5%NaCl,0.05mTBS代替PBS;
③ 用去垢剂 如triton-100处理切片。 Tween-20等;

3.二抗与组织中的Ig结合
如羊抗兔的二抗,二抗可以标本中(人)Ig发生交叉反应,科学上越接近的动物,交叉反应越
明显,如人与猴,兔与豚鼠。
避免方法:用与待测组织相同的5%的正常血清稀释二抗。如人血清。

4.组织中残存醛基与Ig的结合
如醛类固定后未能彻底的冲洗,残流醛基可以和Ig结合。
避免方法:
①彻底冲洗;
② 0.02%的新鲜的硼氧化钾液处理10分钟后冲洗;

5.内源性过氧化物酶
红细胞,粒细胞的含量尤其高,镜下可以识别,不要将其当成阳性结果。
避免方法:
① 石蜡切片 0.3%双氧水-甲醇溶液处理切片;
② 冰冻切片 3%双氧水处理切片5分钟(99:1)因为未经固定包埋,大部分酶未被破坏;
③ 对于骨髓涂片
最好用非过氧化物酶标记的抗体
如碱性磷酸酶(AP)

磷酸萘酯+水→α-萘酚+偶氮染料

快兰(fast blue)或快红(fast red)
↓ ↓
兰色 红色
用明胶甘油封片,不能用含二甲苯的封片剂,溶于二甲苯。

6. 内源性生物素
以 24mg/ml的卵白素封片15分钟;
7. 交叉反应
PcAb敏感性高,但特异性稍低,容易出现非特异性染色。
避免方法:
①尽可能稀释抗体;
②尽可能用McAb;