雾岛さくら合集:蛛 毒 (镇 痛) 长 效 注 射 微 球

来源:百度文库 编辑:九乡新闻网 时间:2024/03/29 05:45:46

 

 

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广西聪宝保健品有限公司

20065






     

 

 

1.  虎纹捕鸟蛛的生物学特性

 

2.  虎纹捕鸟蛛的饲养与繁殖技术

 

3.  不同饲养方法对虎纹捕鸟蛛生物学特征的影响

 

4.  虎纹捕鸟蛛毒的生物学活性鉴定

 

5.  饲养条件下虎纹捕鸟蛛繁殖行为观察

 

6.  虎纹捕鸟蛛发育起点温度和有效积温研究

 

7.  虎纹捕鸟蛛毒素提取的研究

 

8.  虎纹捕鸟蛛毒效的实验观察

 

9.  虎纹捕鸟蛛雌蛛粗毒毛细管区带电泳分离分析

 

10.  虎纹捕鸟蛛(Selenocosimia huwena)对蟾蜍神经肌肉接头传递的影响

 

11.  虎纹捕鸟蛛毒素一I对全脑缺血再灌损伤大鼠海马组织中TNF凋亡通路的影响

 

12.  虎纹捕鸟蛛毒素一I(HWTX—I)对豚鼠回肠的作用机制研究

 

13.  虎纹捕鸟蛛毒素.I天然突变体的分离纯化与鉴定

 

 

 

 

 

 

 

 

一.虎纹捕鸟蛛的生物学特性

 

摘要:简要介绍了虎纹捕鸟蛛的生物学特性,包括它的形态特征、生活习性、捕食行为和食谱,以及生长特点和繁殖习性等.

 

关键词:虎纹捕鸟蛛;生物学特性;趋光性

 

虎纹捕鸟蛛(Ornithoctonus huwena)是一种大型有毒的穴居蜘蛛,是一种重要的经济动物.在动物分类学上,它隶属于节肢动物门、有螯亚门、蛛形纲、蜘蛛目、原蛛亚目、狒蛛科(Theraphosidae)、捕鸟蛛亚科.因其身体多毛、腹部背面有虎皮状花纹而得名.梁宋平对其蛛毒分子结构和生理功能进行了研究,发现其中含有多种酶类及数十种有重要科学价值的活性成分.这一研究揭示了该蛛毒是研制新型药物包括抗癌药物的新药源,具有广泛的开发应用前景,现已引起国内外医学界的极大关注、可见该蛛不仅在科学研究中具有重要理论价值,而且在生产实践上有重要意义.为此,笔者对虎纹捕鸟蛛的生物生态学特性及其人工饲养技术进行了系统报道,以期为该濒危物种的迁地和就地保护提供理论依据,为进行大规模人工养殖提供技术指导,为有关科研单位和制药部门提供优质蛛源.

1 形态特征

1.1 雌成蛛的形态特征

雌成蛛体长50 mm,腹部26 mm×15 mm,8眼集于一丘,前眼列前曲,后眼列近直线排列,前侧眼>后侧眼>前中眼>后中眼.前中眼间距与前中眼直径之比为7:8,后中眼间距与后中眼直径之比为25:8.整个身体被浓密的黑褐色绒毛或长毛,头胸部黑褐色,颈沟和放射沟明显,中窝横向,螯肢内齿堤具18齿和许多小齿,外齿堤无齿,触肢基节前侧和螫基外侧生有许多等长的羽状毛,胸板长大于宽,可见胸斑一对,角肢基节和下唇上生有颗粒状突起,跗节3爪,上爪下有2栉齿,下爪无齿,触肢和步足跗节背面有许多颗粒状毛,各步足跗节和后跗节有毛丛,足式为1,4,2,3.腹部背面灰褐色,有5条黄色矢状纹,两侧颜色稍淡,前纺器一节,间距小于其直径,后纺器梢节较长.

1.2 雄成蛛的形态特征

雄成蛛体长44 mm,头胸部22 mm×19 mm,腹部22 mm×14 mm.背甲黑褐色,头区及胸区周缘密布黄褐色长毛.8眼位于一扁椭圆形丘上,眼的排列及各眼大小比例与雌成蛛相同.中窝弧形凹陷、前曲,中窝到头区前缘微倾斜,胸甲赤黑褐色、枣形,长大于宽,四周布满绒毛,胸侧缘有金褐色粗刚毛组成浓厚的毛丝,外齿堤无齿,内齿堤有16枚,其中近螯爪的一端4齿较大,外侧被短毛,其问有短棘3丛,为发声器的另一组成部分,此棘与螯肢外侧小棘相对磨擦成声,共同组成发声器.步足黑褐色,粗壮而长,多毛.后跗节的大半部分和跗节的整个腹面有天鹅绒似的毛丛.爪稍弯曲,爪下有爪垫.腹部黑褐色,长卵圆形,被浓密金褐色毛,其黑色斑纹与雌蛛同,呈虎纹.前纺器小,呈小锥状,后纺器大,鞭状,由腹侧

绕腹部末端弯向背侧.触肢跗节密布金褐色刚毛和绒毛.从外侧看,跗节远端隆起,被浓毛.但从内侧看,此端中央凹陷,形成一环状圆圈,上生浓密的毛.生殖球赤色(生活时更加鲜红),圆球形,插入器粗而扁,沿中轴方向纵凹,呈长匙状.

2 生活习性

虎纹捕鸟蛛是变温动物,且具负趋光性,在湖南地区5~8月为虎纹捕鸟蛛进行繁殖和卵的胚胎发育时期,5月中旬至7月期间为虎纹捕鸟蛛求偶和交配的最佳时期.在常温下,活动节律的主导因子是温度,当温度在22~25℃ 之间(±2℃ )时,其活动最为频繁,温度过高或过低都会影响其活动,当温度低于15℃ 或高于35℃ 时很少有虎纹捕鸟蛛出洞活动(20~30℃ 为适宜温度),成蛛在气温5℃ 以下,幼蛛在气温10℃ 以下进入冬眠状态.我们用50头蜘蛛经观察统计,结果表明虎纹捕鸟蛛在5~ 8月这段生长旺盛及繁殖期有4个明显的活动高

峰期,分别在下午19~20时之间,夜晚22~24时,2~4时及上午6~7时之间,而从上午8时~下午19时之间则很少有活动情况,同时,该蛛具有较强的耐饥力和相互残杀食性.

3 捕食行为和食谱

当虎纹捕鸟蛛发觉洞口蛛丝被猎物触动时,即出洞捕食.发现猎物后,表现出一种进攻姿态:头胸部向上抬起,连同第一、第二对步足一起向上举起,腹部及第三、第四对步足着地支撑身体,触肢伸展,螯肢张开,螯爪伸出,身体伺机快速移向攻击对象,利用其触肢和螯肢钳住食物,毒汁随即由螯爪尖端人猎物体内,将其麻醉,并迅速将猎物送人口内压碎,注入唾液,使猎物组织器官液化,然后吮吸体液,剩下的食物残渣呈食糜状,未见留下猎物完整的体壳.经野外调查和鉴定洞穴内猎物残骸得知,在自然状况下,虎纹捕鸟蛛只捕食活动的小型低等动物,如蟋蟀、蝗虫、蚱蜢等直翅目昆虫,以及鞘翅目、半翅目和蜚蠊目的某些种类,还可取食新鲜的猪肝、黄粉虫、地鳖虫等.另外,在人工饲养条件下也可食取人工配制的蛋白质混合液体饵料.

4 生长特点与繁殖习性

4.1 生长特点

以幼蛛体质量的增长率、蜕皮率和存活率3个指标测定其生长发育特点,通过温度和食物对幼蛛生长发育的交叉影响试验l4 J,我们发现,随着温度的上升,3龄幼蛛的生长率明显的出现递增期(18~23℃ )和递减期(23~28℃ )2个阶段,以温度为23℃ ,食物为猪肝处理组的幼蛛体质量增加最高,其体质量增长率为31% ,说明最有利于幼蛛生长发育的温度和食物因子组合为温度23℃ ,食物为猪肝.

4.2 繁殖习性

该种蜘蛛在广西原产地每年4~11月为繁殖季节,在长沙地区一般为4~5月交配,交配前,雄蛛用触肢器敲击雌蛛洞口中的信号丝,待雌蛛作出友好回应,雄蛛才进入洞穴,有时雌蛛也爬出洞外与雄蛛交配,交配时,雌蛛仰卧,雄上雌下,左右触肢器交替插入雌蛛的生殖厣中,交配时间为1.5 h,在人工养殖时,注意交配完毕后,赶快移走雄蛛,否则,雌蛛将以雄蛛为食.6~7月产卵,产卵前,雌蛛首先组一个产卵垫,接着把卵粒产在产卵垫上,最后构织成一个结实的卵囊,卵囊平均重量为10.709g±4.19 g,大,J、为(4.23 cm±0.6 cm)×0.6 cm,卵粒数量从几十到几百不等,产出后卵囊即由母蛛用附肢抱住在头胸腹面孵卵,1月左右后方可孵化.刚产的卵囊为纯白色,随着胚胎发育,其颜色逐渐加深,孵化时外观卵囊为黄褐色.若蛛孵出后第1次、第2次蜕皮均在卵袋内进行,2次蜕皮后,2龄若蛛破卵囊而出,呈聚集型生活在母蛛体上及周围,无自相残食现象.待1~3 d后,蜕皮成3龄若蛛,再从母蛛洞中分散,各自营独居生活,此时由于若蛛觅食能力弱,大量出现自相残食现象,进行人工饲养时,此时必须分离饲养

 

 

二. 虎纹捕鸟蛛的饲养与繁殖技术

 

摘 要 :本文简要介绍饲养、繁殖虎纹捕鸟蛛的技术,包括它的形态特征、生活习性、食物种类及饲养器具等并介绍了在饲养和繁殖中应注意的一些问题.

 

关键词: 虎纹捕鸟蛛;饲养击繁殖拄术;形态特征;生活习性

 

虎纹捕鸟蛛主要分布于北回归线以南的热带、亚热带山区和半山区,是一种大型穴居、不耐寒的剧毒稀有动物。在动物分类学上,它隶属于节肢动物门、有螯亚门、蛛形纲、蜘蛛目、原蛛亚目、捕鸟蛛科(Theraphosidae)。梁宋平等(1995)对其蛛毒分子结构和生理功能进行了研究,发现其中舍有多种酶类及数十种有重要科学价值的活性成分这一研究揭示了该蛛毒是研制新型药物包括抗癌药物的新药源。近年来,国内外对蜘蛛毒素的研究非常活跃,尤其对个体大、单蛛产毒量高(1ml/次)的虎纹捕鸟蛛毒索研究更具魅力,但由于蛛源匠乏,极大地影响了其研究进程,而开展引种驯化的人工繁殖技术的研究是解决这一难题的关键,且是蛛毒出口赚取外汇的一条重要途径。因此,我室在国家自然科学基金的资助下,自1 994年姒来,对其生物学、生态学及其人工饲养与繁殖技术进行了较系统的研究,本文就该蛛的饲养与繁殖技术作简要介绍。

 

1 形态特征和生活习性

1.1 雌成蛛的形态特征

雌成蛛体长50.00mm,腹部26.00mm ×15.00ram,8眼集于一丘,前眼列前曲,后眼列近直线排列,前侧眼>后侧眼>前中眼>后中眼。前中眼间距与前中眼直径之比7:8,后中眼间距与后中眼直径之比25 8。整个身体被浓密的黑褐色绒毛或长毛,头胸部黑褐色,颈沟和放射沟明显,中窝横向,螯肢内齿堤具18齿和许多小齿,外齿堤无齿,触肢基节前侧和螫基外侧生有许多等长的羽状毛,胸板长大于宽,可见胸斑一对,触肢基节和下唇上生有颗粒状突起,跗节3爪,上爪下有2栉齿,下爪无齿,触肢和步足附节背面有许多颗粒状毛,各

步足跗节和后跗节有毛丛,足式为1,4,2,3。腹部背面灰黑褐色,有5条黄色矢状纹,两删颜色稍淡,前纺器一节,间距小于其直径,后纺器梢节较长.

1.2 雄成蛛的形态特征

雄蛛体长44.00ram 头胸部22.00×1 9.00ram}腹部22.00×14.00mm。背甲黑褐色,头区及胸区周缘密布黄褐色长毛 8眼位于一扁椭圆形丘上,眼的排列及各眼大小比例与雌蛛相同。中窝弧形凹陷、前曲,中寓至头区前缘微倾斜,胸甲赤黑褐色、枣形,长大于宽,四周市满绒毛,胸斑一对。螯肢内外侧扁,外侧微隆起,南面凹扁,腹侧缘有金褐色粗刚毛组成浓厚的毛丛,外齿堤无齿,内齿堤1 6枚,其中近螯瓜的一端4齿较大,外侧被短毛,其间有短棘3丛,为发声器的另一组成部分,此棘与螯肢外侧小棘相对磨擦成声,共同组成发声器。步足黑褐色,粗壮而长,多毛。后跗节的大半部分和跗节的整个腹面有天鹅绒似的毛丛。爪稍弯曲,爪下有爪垫。腹部黑褐色,长卵圆形,被浓密金褐色毛,其黑色斑纹与雌蛛同,呈虎纹。前纺器小,呈小锥状,后纺器大,鞭状,由腹侧绕腹部末端弯向背侧。触肢跗节密布金褐色刚毛和绒毛。从外侧看+跗节远端隆起,被浓毛。但从内侧看,此端中央凹陷,形成一环状圆圈,上生浓密的毛。生殖球赤色(生活时更加鲜红),圆球形,插入器粗而稍扁,沿中轴方向纵凹,呈长匙状。

1.3 生活习性

虎纹捕鸟蛛是变温动物,且具负趋光性,在南宁地区5月一8月为虎纹捕鸟蛛进行繁殖和卵的胚胎发育时期,5月中旬~7月期间为虎纹捕鸟蛛求偶和交配的最佳时期,在常温下活动节律的主导因子是温度,当温度在22—25 C之间(士2 C)时其活动最为频繁,温度过高或过低都会影响其活动,当温度低于1 5℃或高于35C时很少有虎纹捕鸟蛛出洞活动(20—30℃为适宜温度)。我们用5O头蜘蛛经观察统计,结果表明虎纹捕鸟蛛在5-8月这段生长旺盛及繁殖期一天有四个明显的活动高峰期,分别在下午19:O0—2O:00之间,夜晚22:。O一0:00,2:OO一4:O0,及上午6:O0—7:OO之间,而从上午8:00一下午19:00之间则很少有活动’情况。

 

2 饲养工具及设施

2.1 专业工具

水银温度计、地温计、湿度计、培养皿、Kw一1型控温仪、大小镊子、分析天平、游标卡尺、托盘天平、解剖刀及解剖针、体视显微镜。

2.2 饲养器具

6×]0m 的网棚、120×80cm 的钢架窗纱网笼箱、78×52×4 6cm的养殖池、28×17×25cm玻璃缸。

2.3 辅助工具

纱布、脱脂棉、橡皮筋等.

 

3 饲养与繁殖

3.1 采集

从原产地采集各种蛛态(卵、若蛛、亚成体、成体)活体,用市售有孔肥皂盒,盒内放吸水棉球养,单蛛带回实验室饲养观察。

3.2 方法

3.2.1 棚养法在野外用钢管和塑料窗纱围成规格为6×10m的网棚,窗纱下边入土20cm,条件较好的,可用水泥、瓷砖砌成50cm 高的基脚,并固定窗纱的下缘,以防蜘蛛逃逸,棚内地貌和植被均模拟蜘蛛原产地生境,即选择灌木、植被丰富的30。左右的斜坡并按蛛体大小设洞穴若干,洞内朝外一方用木板遮掩,以便揭盖观察。分别将若蛛和成蛛投入洞穴内 另设饮水器和投饵盘数个,每周投饵、放水2次,以观察虎纹捕鸟蛛能否在南宁地区自然条件下正常生活。

3.2.2 笼养法室外置l0个规格为120×70×80cm 的钢架窗纱网笼箱,箱内用30cm 厚的红色粘土,筑成30。的斜坡,按上法模拟原产地生境,设置洞穴2个,分别投入雌、雄成蛛一对,用于观察蜘蛛捕食和繁殖行为等。

3.2.3 池养法室内建3O个规格为78×j2×46cm的养殖池,分别在每个池中用红色粘土按上法设置洞穴一个,为保持土壤及空气湿度,池内移植苔鲜植物,用于观察蜘蛛生长发育、行为与环境的关系。

3.2.4 缸(或桶)养法置规格为28×1 7×25cm的玻璃缸,或用家用的塑料提桶,分别在每个缸底或柄底先铺一层5cm厚的红色粘土层,并筑一大约30 的斜坡,坡高约10cm,沿缸(或桶)壁筑一个圆形洞穴,单蛛饲养,缸(或桶)中亦移植苔藓植物,并设饮水器、投饵盘各一,用于观察若蛛的生长发育和行为。以上方法的洞穴长度和洞口直径大小的设置可按下列回归方程计算:蜘蛛体重对洞口直径的回归方程为:Y=e。491)3z,r一0.8836i蜘蛛体重对洞穴长度的回归方程为:Y=e ,r:0.71 70,洞穴土壤含水量为l6—22 ,土壤pH值设置为0.1——0.2 。

3.3 产卵和孵化

该种蜘蛛在广西原产地每年4—11月为繁殖

季节,一般为4—5月交配,6—7月产卵,卵囊平均重量为10.7O9±4.19g,大小为4.23

±0.6×0.6cm,卵粒对卯囊重(克)的回归方程为:Y=15.0079x一34.4936,r—O.9987。按照上述公式只要称卵囊重量无需解剖卵囊即可计算该卵囊内所含的卵粒数量。产出后即由母蛛用附肢抱住在头胸腹面孵卵,一月左右后方可孵化,注意在孵卵期间保持环境安静,提供猪肝等营养丰富的食物。刚产的卵囊为纯自色,随着胚胎发育,其颜色逐渐加深,孵化时外观卵囊为黄褐色若蛛孵出后第一次、第二次蜕皮均在卵袋内进行,如果要确切了解卵的孵化和蜕皮时间,可用解剖刀或解剖针稍微划破卵袋,以便进行观察。二龄若蛛破卵囊而出,呈聚集型生活在母蛛体上及周围,无自相残食现象。待1—3天后,蜕皮成三龄若蛛,再从母蛛洞中分散,各自营独居生活。此时由于若蛛觅食能力弱,大量出现自相残食现象,必须进行分离饲养。在母蛛孵卵及孵化后的一个月之内,尽量减少阳光的直射,并且注意降低环境温度,最好使土温保持在25 C左右,这样有利于保持较高的若蛛成活率,如气温持续高于33c,则若蛛的成活率不到 30%.

3.4 分养

对三龄若蛛应以缸养法饲养。注意把若蛛移入缸中时,宜用毛笔驱赶切勿用镊子等夹取,以防受伤死亡。同时用窗纱二层盖住缸口并用橡皮筋扎紧,以防逃逸,这样既利于通气,又便于观察和投饵。再按要求进行编号,并作详细记载。五龄以上若蛛采用池养法,成蛛、亚成蛛采用笼养法和栅养法

3.5 供水与喂食

3.5.1 供水水是蜘蛛生长发育、繁殖必不可少的条件,如何供水?根据我们的经验,对若蛛来说,在玻璃缸或养殖池内的饮水器中,放入吸满水至饱和的棉球,每天换棉球一次,这样既可防止若蛛被承淹死,又可防止棉花生霉发酵,影响若蛛的健康。对成蛛、亚成蛛来说,只需在网棚或笼箱的饮水器中加满水即可,每周换水二次。

3.5.2 食物虎纹捕鸟蛛为肉食性动物,捕食范围广,主要捕食蝗虫、蟋蟀、黄粉虫等昆虫,也捕食青蛙和鸟类。但室内养殖若蛛最好用新鲜猪肝,辅以低龄黄粉虫及人工配制的蛋白混台饵料;亚成蛛和成蛛以黄粉虫幼虫、地鳖虫、直翅目及鞘翅目等地面活动昆虫饲养。

3.5.3 喂食方法首先应视蜘蛛大小控制食物的投入量,食物过剩造成浪费并容易腐烂发霉,少则不利于蜘蛛的生长。如用猪肝饲养若蛛,则把猪肝切成绿豆大的3— 5小块,用镊子夹入整齐地放在投饵盘上;如用低龄(五龄以下)黄粉虫,则把幼虫投入洞穴中即可,每洞穴投入2—3条i如用人工液体饵料饲养若蛛,则把小棉球投入液体饵料中浸泡至饱和,然后夹出并整齐地放在投饵盘上,每盘上放3—5个小棉球,每四天投饵一次 根据室内捕食功能反应试验结果表明,虎纹捕鸟蛛成蛛在不同温度下的功能反应式为:Na—I 6.9587EXP (一12.8932Nt一 )r= 0.998(t>t 。 ),常温下(25 C左右),单蛛饲养最大捕食量为5—6头/天,据此,以黄粉虫幼虫饲养成蛛和亚成蛛,则把3—5头黄粉虫投入洞穴中即可,每周投饵3次。由于虎纹捕鸟蛛具负趋光性,因此每次喂食均定在下午六点半之后,第二天清晨及时把吃剩的食物取出,并擦净投饵盘,以防食物生霉变昧,影响蜘蛛健康。

 

4 越冬管理

虎纹捕鸟蛛是一种不耐寒的稀有动物,5 C以下就有致命危险,因此,做好越冬管理是饲养、繁殖虎纹捕鸟成功的一个关键环节之一,具体办法为:

4.1 越冬前尽量做好虎纹捕鸟蛛的营养补充,并加厚洞穴覆土,使覆土达20cm 以上。

4.2 因地制宜,可在覆土上采用农用塑料薄膜加稻草等保温性能较好的材料覆盖,这样可基本保持土温在5C以上。

 

5 注意事项

5.1 虎纹捕鸟蛛是一种生长发育迟缓、不耐寒的濒危动物,其适宜温度为20—30 c,最适宜温度为23—28℃15C以下,3j c以上停止活动,土温5C 下就有致命危险,因此,为了饲养成功,在发育期间要尽量保持土温在2O一28C之间,土壤含水量为1 6—22 ,空气相对湿度在8O 以上,土壤酸碱度为pH5.im5.5之间

5.2 蜘蛛蜕皮期间是其生命力最脆弱的时期,此时应特别加强管理,设法保持环境安静,尽量减小人为干扰(如噪音、振动等),并且及时把蜘蛛蜕的皮清理出去,以防蜘蛛生病

5.3 在炎热的夏天进行室内饲养时,每天用水喷雾两次,以保持土壤及空气湿度{室外网棚和笼箱饲养成蛛、亚成蛛时,需用绿色树枝、草木作隐蔽物,以便降低气温与土温。

 

 

三.不同饲养方法对虎纹捕鸟蛛生物学特征的影响

 

摘要:为探明不同饲养方法对虎纹捕鸟蛛取食、死亡和产毒量的影响,应用缸养法和篓养法对虎纹捕鸟蛛进行室内人工饲养.结果表明:虎纹捕鸟蛛产毒和取食率方面,篓养要显著优于缸养(P<0.01);在死亡率方面,两种饲养方法差异不显著(P>0.05) .篓养更适合室内人工饲养虎纹捕鸟蛛.

 

关键词:虎纹捕鸟蛛; 饲养方法; 生物学特性

 

虎纹捕鸟蛛(Ornithoctonus huwena)是一种古老的大型有毒穴居动物(雌蛛平均体重:l9.54±7.72 g,雄蛛平均体重:9.31±7.59 g),它的分布受环境条件影响很大,其自然种群仅分布于我国北回归线以南的热带地区.目前,对虎纹捕鸟蛛的研究主要集中在生态学、生物学和毒性毒理方面.研究表明虎纹捕鸟蛛的蛛毒中含有多种酶类及十多种有科学价值的生物活性成分 I4 , 其中一些成分的结构和功能已经解析1 5 .虎纹捕鸟蛛毒素一I(Huwentoxin—I,HWTX—I)是虎纹捕鸟蛛毒液中含量最多的一种成分,实验证明其具有镇痛活性lJ卜 ,是一类天然非成瘾的多肽药物.该毒素已作为国家一类药物进入临床试验,有望开发成为一类新的镇痛药物.一旦开发成功,必将需要大量毒素用于药物生产.此外,由于虎纹捕鸟蛛个体大,是一种理想的模式动物,可应用于蜘蛛神经生物学和生理学等方面的研究.目前, 由于人为干扰,栖息地的破坏和环境污染等因素,该种蜘蛛自然资源日趋枯竭,处于濒危状态.为保护这种濒危物种,并将其毒素用于科研和药物开发,人工饲养虎纹捕鸟蛛显得尤为重要.本文首次以塑料篓子和玻璃缸两种方法饲养虎纹捕鸟蛛,对其取食量、死亡率和产毒量分别进行了统计分析,旨在寻求一种好的饲养方法, 为虎纹捕鸟蛛在湖南境内的人工饲养和实现其迁地保护的可行性提供科学依据.

 

1 材料和方法

1.1 试蛛

虎纹捕鸟蛛采自广西宁明县桐棉乡的山上,活体带回南宁并在实验室室内采用塑料篓或玻璃缸饲养.室内温度控制在22—28 qC,相对湿度为65—90% ,光照为自然光.采用塑料篓饲养和玻璃缸饲养的蜘蛛分别为125只(其中雄蛛8只 和119只(雄蛛8只).各饲养组蜘蛛的平均体重经t检验没有显著的统计学差异.

1.2 方法

1.2.1 饲养方法

(1)缸养法:将单头蜘蛛分别置于规格为25 cm x10 cm×15 cm的玻璃缸中.在每个缸底先铺一层5 cm的红色黏土,筑成30。的斜坡,坡高大约10 cm.在斜坡的中部筑一个圆形洞穴,洞口大小与将要放入的蜘蛛的大小相对应,洞紧靠一侧缸壁而筑,便于观察.缸中放入水盘和食物盘.玻璃缸上面用玻璃盖盖好,防止蜘蛛逃跑.

(2)篓养法:置直径为20 cm高为30 cm的圆形塑料篓中.篓子里面模拟环境和玻璃缸里一样.用纱布盖住篓子口,用松紧带把纱布固定好,防止蜘蛛逃跑.

1.2.2 蜘蛛采毒量测定试验:将野外采回的蜘蛛分别放入塑料篓和玻璃缸中,立刻进行蛛毒采集,统计发现饲养前塑料篓和玻璃缸中单蛛平均产毒量差异不显著.饲养后每两周采毒一次,计算出各饲养蜘蛛的平均产毒量,然后再分别算出两种饲养方式下单蛛的平

均产毒量,并进行差异性t检验.蜘蛛毒素的采集时间统一为双周的星期三下午.1.2.3 蜘蛛取食量测定试验:将蜘蛛在室内饲养一个星期后喂食,将猪肝切成1—2 em 的小块放入食皿中.投食时间为每个星期一下午三点到五点,星期二上午八点到十点将食皿从饲养器皿中取出,食皿放置时间每次为15—19 h.统计每次蜘蛛进食的情况,计算出每个蜘蛛的平均取食率,再分别算出两种饲养方式下所有蜘蛛平均取食率,最后对两种饲养条件下的蜘蛛平均取食率进行t检验.统计时将实验过程中死亡的蜘蛛剔除.

1.2.4 蜘蛛死亡率测定试验:将蜘蛛放入玻璃缸和塑料篓喂养三个月后,分别对其蜘蛛的死亡情况进行统计,对统计结果进行x 检验.

 

2 实验结果和分析

2.1 对虎纹捕鸟蛛采毒量的影响

对毒素的研究是人工饲养虎纹捕鸟蛛的一个重要原因, 因此产毒量是一项重要的衡量指标.两种饲养方式下单蛛的平均产毒量见表1.

 

表1 两种饲养方式对虎纹捕鸟蛛采毒量的影响

饲养方式    采集蜘蛛数    单蛛平均产毒量    t检验

篓养        125      18.64±4.08            t=2.67,P<0.01

缸养        119      17.27±3.85

 

由表1看出,篓养时单蛛的平均产毒量大于缸养时单蛛的平均产毒量,而且两者差异极显著(P<0.01),饲养方法的差异可能是导致蜘蛛产毒差异的主要原因之一.

2.2 对虎纹捕鸟蛛取食的影响

实验过程中,塑料篓中死亡蜘蛛8只,玻璃缸中死亡蜘蛛9只.对剩下的蜘蛛取食情况进行统计,结果如表2.

 

表2 两种饲养方式对虎纹捕乌蛛取食率的影响

饲养方式    统计蜘蛛数    平均取食率    t检验

篓养        117            58%           t=8.75,P<0.01

缸养        110           37%

 

表2表明, 篓养时, 虎纹捕鸟蛛平均取食率为58% ,而缸养时为37% .而且两种饲养方式下蜘蛛的平均取食率差异极显著(P<0.01),说明篓养时虎纹捕鸟蛛更喜好取食,而缸养时蜘蛛取食率下降,取食率的下降必将导致蜘蛛体重下降,生长缓慢, 不利于虎纹捕鸟蛛的人工饲养.由此看,篓养要显著优于缸养.

2.3 对虎纹捕鸟蛛死亡率的影响

在人工饲养蜘蛛过程中,死亡率也是一个重要的衡量指标.死亡率的高低关系到人工饲养虎纹捕鸟蛛是否取得了成功.饲养三个月后分别对塑料篓中和玻璃缸中蜘蛛死亡情况进行统计,结果见表3.

 

表3 两种饲养方式对虎纹捕鸟蛛死亡率的影响

饲养方式   死亡蜘蛛数    存活蜘蛛数     死亡率(%)    x2 检验

篓养        31           94              24.8         x2 =0.66,P>0.05

缸养        35           84              29.4

 

表3中数据表明篓养和缸养对蜘蛛死亡率的影响差异不显著.也就是说饲养方法的差异可能不是导致蜘蛛死亡差异的主要原因.

 

3 讨论

对于虎纹捕鸟蛛的研究报道主要集中在其生态学习性、生物学特征和毒素研究等方面.颜亨梅等对虎纹捕鸟蛛的生态学特征进行了详细研究,包括生态分布特点、洞穴结构、活动规律、捕食和防御进攻等方面.王智对虎纹捕鸟蛛人工饲养的生态条件进行了摸索,介绍了人工饲养时土壤的最适条件以及光照和噪音等对其生长的影响0 .本文主要比较了两种饲养

方法对蜘蛛取食,死亡和产毒量的影响.从整体来说,篓养要优于缸养.由于玻璃缸不透气, 缸内环境与室内环境相差很大,如果不向缸内加水,土壤就比较干;如果加水,土壤又比较湿.缸内的水分不容易蒸发,土壤中的水分也很难溢出来.所以缸内的环境是要么很湿要么很干,与自然环境差异大,很难模拟.而篓养则不同,篓子周围都有空隙,通透性很好.篓内环境更接近自然环境,土壤中多余的水分也可以从洞口中溢出,不会出现过于或过湿的情况.两种饲养方法环境的不同很可能是导致蜘蛛在进食、产毒方面差异很大的重要因素之一.

在实验室人工饲养条件下, 由于这种蜘蛛的特殊性(个体大,穴居),对于其饲养方法、生活条件,栖息环境等方面,还需要进一步改进.蜘蛛取食量测定实验中,由于食物来源难以充足保证,仅仅做猪肝这种食物,对于虎纹捕鸟蛛野外主要的捕食猎物(蚱蜢、蟋蟀、蝗虫、蟑螂等)没有作为取食食物用于实验.蜘蛛死亡率测定实验表明在室内人工饲养中,蜘蛛死亡率与饲养方法没有显著关联,也就是说饲养方法的不同可能不是导致蜘蛛死亡的主要原因.那么在人工饲养中,导致蜘蛛死亡的主要原因是什么? 是食物和环境的模拟?这种猜测还有待于进一步研究.

 

 

四.虎纹捕鸟蛛毒的生物学活性鉴定

 

摘要: 本文报道了采集广西产虎纹捕鸟蛛(& n。c邮删埘^ n)毒藏的方法.并对粗毒进行了部分生物学活性的测定.像粗毒对小鼠和蜚辕的LD50分别为I 16 mg/kg和300 g/ g。该粗毒具有透明质酸酶.碱性磷酸酶.蛋白术解酶和脱氧棱糖棱酸酶括性。未测到磷脂酶A和胆碱脂酶活性。通过电生理实验发现该粗毒含有阻断螗蜍神经肌肉接头传递的毒素.并观察剜当小鼠接受琏腔注射致死剂量(5 mg/ )粗毒后梗迅速出现呼强麻痹。

 

关键词:蜘蛛毒 ,虎纹捕鸟蛛,神经毒素,透明质

 

在我国广西宁明,云南勐海一带发现的虎纹捕鸟蛛,最近被鉴定为蜘蛛新种,属于捕鸟蛛科(Theraphosidae),定名为Selenocosmiahuwena (王家福,1992)。此蜘蛛穴居地下,穴呈圆形,深约40---lO0 gln,洞口布以蛛网。雌性体长6--9 cm,步足长6一lO cm, 重2O一30 g,身体多毛,腹部背面有虎皮状花纹,螯爪长约l cm,坚硬锋利,经诱食或刺激后射出毒液。广西宁明县常有家畜被其咬伤的记录。牛在吃草时鼻部被咬伤后,出现烦燥, 口渴,衰竭,严重者可致死亡。对蜘蛛毒的研究,由于采毒较困难, 因而不如蛇毒和蝎毒的研究那样广泛深入。国外蛛毒研究较为深入的有漏斗蛛(,4trax robustus和Agelenopsis aperta) (Skinner等,1989;Brown等, l988)、平甲蛛(Loxosceles reclusa) (Jong等,1979)和黑寡妇蛛(Latrodectus mactans tredecimguttatus)(Grasso等,1976)等。在这些蛛毒中发现有多种酶类以及对哺乳动物,昆虫神经系统有选择性作用的一些神经毒素。我国学者发现新疆穴居狼蛛(Lycosa singoriensis)粗毒中有对谷氨酸能神经肌肉接头传递有阻遏作用(徐科等,1986), 还有抑菌多肽以及抑制肺腺癌培养细胞生长的组分(徐科等,1989;赵维勤等,1991)。目前对捕鸟蛛科Selenocosmia属的蜘蛛毒的研究尚未见报道。本文报道虎纹捕鸟蛛毒液的采集以及部分生物学活性的测定结果。

 

材料和方法

1.材料活虎纹捕鸟蛛采于广西宁明县。昆明种小鼠购自湖南医科大学动物房。美洲蜚蠊由北京大学实验东馆提供。透明质酸、磷酸二对硝基苯酯、酪蛋白、牛血清清蛋白为上海风生化试剂厂出品。小牛胸腺DNA为上海奶制品厂出品。卵磷脂为四川大学出品。溴化乙酰胆碱为上海化学试剂三厂出品。比色测定使用日本U-2000型紫外可见分光光度计, 电生理实验使用LMS-2B型二道生理记录仪(成都仪器厂出品)。

2.捕鸟蛛毒液的采集将3—4根长约4 cm 内径为1.5 inln的透明塑料软管捆成一束作为诱物,用大镊子从侧面夹住蜘蛛胸部,蜘蛛便张开螯爪,这时将软管束诱物进人螯爪下,它即用触肢抱住软管束,将螯爪有力地刺人软管内射出毒液。由于每只蜘蛛的两个螯爪通常并不同时射毒,且每次每个螯爪不一定射出全部毒液,因而上述过程需进行多次。射毒后从螯爪下慢慢抽出软管束,用微量注射器将其中的毒液抽出,毒液经冰冻真空干燥后得到的白色(略带微黄)干粉即为粗毒。

3.ID 测定LD (小鼠)的测定用昆明种小鼠, 雌雄不分, 每只体重2O g左右, 分为5组, 每组6只。粗毒用生理盐水溶解,按每公斤体重1 5、1.24.1.02.O.83 mg剂量腹腔注射,注射体积为每只小鼠2O l,第5组注射2O 1生理盐水,观察24 h。LD (蜚蠊)的测定用美洲蜚蠊,共分5组,每组6只,粗毒用昆虫生理盐水溶解,按蜚蠊每克体重150、225、337、500/lg剂量从第四 五腹板交接处注人腹腔,对照组注射等体积的生理盐水,观察24 h。LD 。的计算按改良寇氏法公式:LD n=log_。( "一i( _0.5))式中为最大剂量对数值,P为动物死亡率,Ep为各组死亡率的总和,i为两组剂量比的对数。

4.蛋白质含量的测定按Lowry法(1951)进行,以牛血清清蛋白为标准。

5.酶活性测定

透明质酸酶: 基本按Ferrante(1956) 比浊法进行。反应总体积1 ml, 其中底物O.4 ml(1 ml pH5.0乙酸缓冲液中含透明质酸500/lg),O.2M pH5.0乙酸缓冲液(内含0.15M Nac1)0.55一O.59 ml,3717预保温2O rain后加入酶液1O一5O/11,37"C反应15 rain, 立OP:0t1人4 ml内含2.5% 十六烷基溴化三甲基铵的2%NaOH液,30 min后在400 hill比浊, 以200 g底物形成的浊度被降低50%所需的酶量为一活性单位。

蛋白水解酶: 参照Rich (1963) 的方法, 反应总体积6 ml, 其中含0.5--3.0mg/ml蛛毒溶液1 ml(配在O.O5MTris州c1缓冲液中,pH7.6),2%热变性酪蛋白溶液5 ml(pH7 6)。在3Tc保温60 min,加人5 m1三氯乙酸终止反应,放置20 min后过滤; 取滤液l m1加人O.5N NaOH 2 ml以及1:2.3稀释的Folin试剂O.6 ml,3Tc下放置20 min后在660 hill比色,测定酪氨酸的生成, 以每分钟水解产生1/lg酪氨酸的酶量为一个活性单位。

碱性磷酸单酯酶:参照Bessey (1952)的方法进行, 以硝基酚磷酸二钠盐为底物

胆碱脂酶:参照Pilz(1963)方法测定,以溴化乙酰胆碱为底物。

磷酯酶A:按Hurtado (1964)等人的方法进行,采用大白鼠红血球测定溶血率

脱氧核糖棱酸酶:基本按Ktmitz的方法进行(1964),反应总体积4.0 ml,其中底物DNA溶液3 ml(4 mgDNA溶于50 m1双蒸水,加人lO mI 1.0M pH5.0乙酸缓冲渡和lO m1 O.O5 M 硫酸镁溶液),加入蛛毒水溶液(1—3 mg/m1)1 m1,对照管加双蒸水,测量每分钟260 hill光吸收的增加值,以25"C下每分钟使260 nm光吸收值增加0.001的酶量为1单位.

6.粗毒对蟾蜍坐骨神经缝匠肌标本的作用 剥制蟾蜍坐骨神经缝匠肌标本,将残留的腿骨固定,将缝匠肌肌腱上的结扎线与张力换能器相连,用生理记录仪记录缝匠肌的收缩张力。给以0.3 v,频率为每秒3次的重复电刺激,记录缝匠肌的收缩张力,然后用微量注射器将浓度为3 mg/ ml的粗毒生理盐水溶液分别滴加在神经干和肌肉接头部,期问维持同样强度的电刺激,分别记录收受张力的变化。

7.粗毒对小鼠呼吸与心电图的作用在麻醉(乙醚)条件下,将小鼠(25 g)四肢用乙醇膳涂擦后夹上电极夹,通过Ⅲ导联记录心电。用小钩勾住小鼠剑突处的皮肤,通过换能器记录膈肌呼吸性节律。从叛腔注射粗毒生理盐水溶液3O 1(含粗毒128 g),记录注射粗毒溶液后动物死亡前的心电和呼吸变化。

 

结果与讨论

对蜘蛛毒的研究,已往当数是通过解剖分离毒囊进行匀浆,再用溶剂(水)抽提的方

法来得到粗毒,该方法的不足之处是不能定量反应毒液本身的真实情况,且因混有非毒素成分给以后的分离带来一定的麻烦。针对捕鸟蛛个体较大的特点,我们在研究中采用了一

种从蜘蛛螫爪尖端直接收集纯净毒液的方法,再通过冰冻干燥制成粗毒。我们研究得出了虎纹捕鸟蛛毒液的主要性质见表1。

 

表1 虎蚊捕鸟蛛毒液的部分性质

毒液产率               1O一30 µl/只次

鲜毒液重量             1.12 mg/µl毒液

干物质重(冻干后)       0.23 mg/µl毒液

蛋白质含量             O 774 mg/ mg租毒

LD50 小鼠             1.16 mg/kg体重

LD50 美洲蜚蠊         300µg /g体重

透明质酸酶活性        109 U/mg粗毒

碱性磷酸酶活性        2.26×10-3 U /mg粗毒

蛋白水解酶活性        6.6 ×10-4 U /mg粗毒

DNA酶括性             5.5 g u /mg粗毒

磷脂酶A 活性          0 U/mg租毒

胆碱酯酶话性          0 U /mg粗毒

 

虎纹捕鸟蛛粗毒对小鼠有较强的毒性,从LD 。的量来看,其毒性要强于少棘蜈蚣(其LD50小鼠为22 5 mg/kg。汪猷等, 1985) 和马氏钳蝎(其LD50小鼠为2.6 mg/kg。吉永华等, 1988),但低于国外报道的漏斗蛛的毒性(其LD 小鼠为0.5 mg/kg)。经腹腔以较大剂量注射后,小鼠表现出喘息,蜷伏, 动作失调,抽搐等症状后死亡。死亡的小鼠有眼球突出的现象。该粗毒对美洲蜚蠊的毒性比较低,大剂量注射后,蜚蠊出现后肢麻痹, 爬行蹒跚,足部抖动,直至死亡。研究中发现虎纹捕鸟蛛毒液中具有较高的透明质酸酶活性,文献报道中大多数蜘蛛毒含有此酶, 它可能有加速毒素向机体组织扩散的作用。按前述方法测定出虎纹捕鸟蛛毒液中具有DNA酶活性后, 又用下述实验作了进一步验证:在盛有小牛胸腺DNA的试管中分别加入35、75、150和300 g的粗毒溶液, 在25E:保温15 rain,用琼脂糖电泳鉴定水解结果。加入150和300 g粗毒的样品将DNA全部水解为小片段,在本实验条件下用溴化乙啶(EB)通过紫外光不能显示出来,而加入35腭蛛毒的样品则能显示出部分DNA片段,因而进一步证实了该蛛毒具有DNA酶活性。粗毒中没有测到磷脂酶A活力,样品浓度增加到5 mg/ ml也不能测到溶血活性。测定中以银环蛇毒为对照,测出银环蛇毒半溶血量(Hu5n)与文献报道的基本一致,因而虎纹捕鸟蛛粗毒中无磷脂酶A活力的结果应该是可靠的。同时,也没有发现该蛛毒具有胆碱脂酶活性,以眼镜蛇毒样品验证了测试方法的可靠性。

 

图l 虎垃辅鸟蛛粗毒对培蜡蛙匠肌坐骨神经的作甩 A 未施毒前 B 在神经干施毒后 C 在神经肌肉接头施毒后由电刺l矗神经引点的蛙匠肌收缩 D 在神经肌肉接头施毒后直接莉矗蛙匠肌产生的收缩粗毒对蟾蜍缝匠肌坐骨神经标本的作用结果见图1。在神经干上滴加3 mg/ m1浓度的粗毒溶液,不能阻断神经冲动传导,给刺激后仍能记录到收缩张力,而在神经肌肉接头部滴加粗毒溶液30 S后,由刺激神经引起的肌肉收缩活动即被抑制。使用Ringer溶液多次冲洗接头部,未见抑制作用消除,但直接刺激缝匠肌仍可引导出与对照相同的收缩张力记录,上述结果初步说明虎纹捕鸟蛛粗毒的上述抑制作用发生在神经肌肉接头部粗毒对小鼠心电和呼吸的作用见图2。腹腔注射较大剂量的粗毒后2O s呼吸即停止,而心电记录却持续了18 rain,其间心律有逐渐减慢的趋势,说明呼吸麻痹是使小鼠致死的首要因素。

 

图2 捕鸟蛛粗毒对小鼠呼吸运动和心电的作用

A 注射粗毒前B 注射后30 s C 注射后l2血记录的呼吸运动和心电

 

结论上述测定表明,虎纹捕鸟蛛粗毒具有较强的哺乳动物毒性和一定的昆虫毒性,并含有透明质酸酶,蛋白水解酶,碱性磷酸酶和DNA酶。粗毒中含有阻断神经肌肉接头传递的神经毒素,致死剂量的粗毒可使小鼠迅速产生呼吸麻痹而死亡。本研究室正在对该蛛毒中的神经毒素和有关酶类进行分离纯化和进一步研究。

 

 

五.饲养条件下虎纹捕鸟蛛繁殖行为观察

 

摘 要:虎纹捕鸟蛛Or ithocto huwena繁殖行为是一系列反射活动。在人工养殖条件下,能引起虎纹捕鸟蛛繁殖行为量的变化.而不能引起质的变化.即不会出现新的繁殖行为。在虎纹捕鸟蛛性行为程序中,行为成分常以固定动作方式有节律地重复演示.呈现仪式化特征。

 

关键词:虎纹捕鸟蛛;人工养殖;繁殖行为

 

由于虎纹捕鸟蛛Ornithoctonus huwena毒素的巨大医用价值,虎纹捕鸟蛛人工养殖日益受到重视。繁殖是虎纹捕鸟蛛人工养殖的关键环节,至今国内还没有系统深入的观察研究报道。现将我们对虎纹捕鸟蛛繁殖行为的观察结果报道如下,以期为人工养殖虎纹捕鸟蛛提供基础资料。

 

1 材料与方法

1.1 材料

成熟虎纹捕鸟蛛雌、雄各1O头,本所实验室人工饲养。交配箱1O个,规格为68×48×24 cm。由木板做成,箱内1/2处用铁丝网窗纱做1个活动隔板,将交配箱分割成2个活动单问,每个单问内铺筑一层6 cm厚的红色粘土,并筑呈3O。斜坡,坡高10 cm,坡面设置1个口径为5~6 cm,洞深为7~8 cm的圆形沿穴。土壤含水量为2O ,pH一4.5~6。每个单间分别设饮水盘、投饵盘各1个。然后每个单问分别投放雌、雄成蛛各1头,用于繁殖行为观察。

1.2 方法

采用行为描述法和行为实验法,定时观察蜘蛛繁殖行为,并作描述记录,进行比较分析,辅以人工繁殖实验,探讨人工养殖条件下虎纹捕鸟蛛繁殖行为演示规律。观察时间:2001年4~8月,累计有效观察时间约900 h。

 

2 结果与分析

2.1 移精与求偶

虎纹捕鸟蛛的繁殖期是在每年的4~8月,求偶行为一般始于4~5月。成熟的雄蛛先在洞穴外与相邻的箱壁问织1张简单的精网,然后腹面朝上将精液排到精网上面,大约15 min后,转身用第1和第2对步足支撑起头胸部,用螫爪勾起精网,2触肢交替抵在精液上吸纳精液,储入纳精球内,这一过程大约需要35 min。完成移精后的雄蛛每到黄昏后常常徘徊在交配箱的活动隔板一侧寻找雌蛛。当取出活动隔板后片刻,雄蛛朝雌蛛方向爬去,但立即在雌蛛面前停下,保持一定距离作静观状态。若雌蛛抬起头胸部,高举第1对步足并张开螯爪,雄蛛便慌忙向后退却。稍后再转身静观,待雌蛛放下步足,收起螯肢,趋于平静后,静观良久的雄蛛再度向前,到一定距离后,便停下用第1对步足敲击地面,微微地摆动着腹部,大胆

向雌蛛传递求偶信号。雄蛛的求偶动作大约持续15 min左右,雌蛛才以同样动作敲击地面,回应雄蛛的求偶信号。这时雄蛛慢慢靠近雌蛛,伸出第1对步足和触肢触摸雌蛛,雌蛛亦主动伸出第1对步足和触肢触摸雄蛛,这是雌蛛表示愿意接受交配的信号。通过对1O头雄性虎纹捕鸟蛛求偶、交配行为对照观察(表1,表2),求偶、交配时间相隔1~26 d,求偶次数1~2次。求偶持续时间15~20 min,交配持续时间40~ 50 min。

表1 虎纹捕鸟蛛求偶交配时间对照表(略)

表2 虎纹捕鸟蛛求偶交配行为量化对照表(略)

2.2 交配

雌蛛表示愿意接受交配后,雌、雄蛛即演示交配行为,其过程是:雄蛛爬上雌腹背,用第1对步足抱着雌蛛腹部,第2对步足搭在雌蛛腹柄两侧,第3、4对步足放在雌蛛头胸部上,雌蛛稍抬起腹部,然后雄蛛将触肢交替插人雌蛛生殖孑L内导人精液。这时可看到雌蛛腹部不停地颤动。交配多在晚间21时以后至凌晨2点进行。交配过程大约需要40~50 min。交配结束后,雄蛛腹部不停地颤动,没有逃离的意象,这时雌蛛转过身咬住雄蛛开始残食。观察10头雄蛛,有7头被雌蛛残食。

2.3 产卵

经过交配后的雌蛛29~65 d后开始产卵。产卵过程以No.4,No.7雌蛛为例,2001年6月14日凌晨1~2时,雌蛛选择稍凹的地方编织产床,产床大小为:长12~14 cm,宽20~22 cm,由数根蛛丝牵拉固定。然后在产床中央编织产盘,产盘直径约5.5 cm。中午11时14分产盘编织完毕,雌蛛开始伏在产盘上,腹部对着产盘中心,触肢和步足将身体撑起,腹部肛突和纺器紧贴产盘边缘,呈静止状态约20 min后,到11时35分,卯粒伴随淡黄色的液体一次排出,液体量约8~10 ml 。卵粒量70~80粒,呈乳白色,直径3~4 mm。随着卵的排出,腹部逐渐变小。排卵的全过程,雌蛛均呈静止姿势。12时19分,卵排完,雌蛛用腹部碾压卵粒,然后便开始泌丝覆盖。丝从腹部紧贴着产盘的边缘开始,至产盘的中心后向右180。转变,继续从产盘另一边缘开始泌丝,如此反复至第9次时,雌蛛开始用触肢将产盘的一边轻轻掀起,每来回泌丝1次就掀起1次,到5时左右,整个产床已被掀起,最终形成一个扁平的圆形卵袋。

2.4 护卵

卵袋做成之后,雌蛛便将卯袋置于胸板下守护。护卵期间,除饮水和取食外,雌蛛很少活动或离开卵袋。一般情况下是固定在一个位置守护,偶见转移到另一地方守护。

2.5 孵化

观察10个卯袋的孵化历期,历期最短的是26 d,最长的是57 d,平均历期41.5 d。6月22日上午9时47分发现第1个卵袋孵出幼蛛,幼蛛陆续从卯袋钻出,汇聚在母蛛身体的上下和周围,不吃不动。第3天以后发现部分幼蛛开始蜕皮,第6天所有幼蛛基本上蜕完皮,逐渐离开母蛛分散到各处,更多的是爬到窗纱盖上。这时我们将母蛛移离交配箱,对幼蛛进行群养观察。营独立生活的幼蛛,已能纺丝作隐蔽所,每2、3头聚集在丝网营群居生活。这时的幼蛛易受惊,稍有惊动便立即钻进丝网或沿穴躲藏。捕食方式与成蛛相同,每次可捕食1~2条幼小的黄粉虫。幼蛛生长较快,一般6~8 d蜕1次皮,由于食物和捕食的原因,幼蛛个体的大小开始有明显的差别,常见个体较大的幼蛛残食个体较小的幼蛛。

 

3 讨论

理论上虎纹捕鸟蛛繁殖期到来以后,由于生理条件发生变化以及温度等环境因子影响,促使虎纹捕鸟蛛求偶及交配。本文观察到饲养条件下虎纹捕鸟蛛的繁殖行为符合上述原则。动物性行为程序中,许多行为成分均是有节律地重演示并且形式常常固定不变。本文观察到在饲养条件下虎纹捕鸟蛛求偶、交配、产卵以及孵化等亦显示出仪式化特征。每年4~8月为虎纹捕鸟蛛繁殖期,饲养条件下,虎纹捕鸟蛛的求偶、交配、产卵以及孵化也多在4~8月。在繁殖期以外未发现有演示求偶、交配等行为,这说明虎纺捕鸟蛛对特定繁殖季节的依赖性。

在饲养条件下,通过对纹捕鸟蛛繁殖行为的观察,虎纹捕鸟蛛在性行为程序演示中,无论是初期的求偶行为成分以及后来的交配、产卵和孵化等行为成分,仍得到充分演示。这说明饲养条件下,能引起虎纹捕鸟蛛繁殖行为量的变化,而不能引起质的变化,即不会出现新的繁殖行为。

 

 

六.虎纹捕鸟蛛发育起点温度和有效积温研究

 

摘 要:实验设置5个温度、3个湿度,对虎纹捕鸟蛛卵袋和幼蛛的发育速率进行测定。结果表明:温度是影响虎纹捕鸟蛛发育的重要因子,湿度对卵历期、幼蛛历期有显著影响。运用优选法计算虎纹捕鸟蛛发育起点温度和有效积温,所得卵和全世代的发育起点温度To分别为l4.3℃ ,7.0℃,有效积温K分别为712.66日度和6l61.80日度。

 

关键词:虎纹捕鸟蛛;发育起点温度; 有效积温

 

虎纹捕鸟蛛Ornithoctonus huwena隶属捕鸟蛛亚科Ornithoctoninae,捕鸟蛛属Ornithoctonus,是近年在广西、云南等地发现的蜘蛛新种(朱明生等,2000)。梁宋平等(1993)从虎纹捕鸟蛛毒液中发现含有多种酶类和数十种有重要科学价值的活性成分,揭示了该蛛毒是研制新型药物包括抗癌药物的新药源(王智等,2000)。研究该蛛的发育起点温度和有效积温,为人工养殖和本类珍贵资源的开发利用有着积极的现实意义。

 

1 材料与方法

1.1 材料

本所实验室人工饲养的虎纹捕鸟蛛卵袋15个。幼蛛75头,从2001年7月虎纹捕鸟蛛卵袋中孵出,随机取样。人工气候箱15个,规格为长25 cmX宽17 cmX高12 cm,箱内铺筑一层4 cm厚的红色粘土,酸碱度为PH 5.6。饲养箱75个,规格为长44 cmX宽28 cmX高24 cm,箱内铺筑一层4~6 cm 厚的红色粘土,酸碱度为PH 5.6。并用粘土筑一30。斜坡,高8~10 cm,在坡面筑一个口径为3 cm 的圆形洞穴。箱内设饮水盘,投饵盘各1个,单蛛饲养。

1.2 方法

1.2.1 卵袋发育起点温度及有效积温实验

设置18~0、21℃、24"C、27 C30 C 5个温度梯度,将15个卵袋随机置人15个人工气候箱内,每一温度下分别设6o o//、7o o//、80 o//3种相对湿度,每天观察气温箱内孵化情况,计算卵历期,直至孵化出幼蛛为止。

1.2.2 幼蛛发育起点温度及有效积温实验

设置18"0、21 C、24℃27 C30℃ 5个温度梯度,每一温度下分别设60 、70 、80 3个相对湿度,每一设置共5个饲养箱,从当年实验卵袋孵出幼蛛中随机取样75头分别置人75个饲养箱内,每天观察3次(10.O0,20.O0,2.O0),记录发育进度,直至成蛛为止(幼蛛历期为观察总幼蛛数的加权平均数)。

1.3 计算方法

本试验采用李超(1985)提出的优选法,估计虎纹捕鸟蛛发育起点温度和发育所需的有效积温。

 

2 结果与分析

2.1 发育历期

试验结果见表1。由表1可看出,温度是影响虎纹捕鸟蛛发育速度的主要因子,在不同温度条件下,各蛛态历期相差很大。发育历期随温度的升高而缩短,随温度的降低而延长,在18℃时卵期139.36d,幼蛛期401.68 d;在30℃时卵期47.84 d,幼蛛期188 d。湿度对虎纹捕鸟蛛卵期、幼蛛期有显著影响,同一温度,在80 相对湿度条件下,卵期、幼蛛期要比70 和60 相对湿度条件下历期短。虎纹捕鸟蛛室内人工饲养在27℃"-~30℃范围内,相对湿度在80 时发育历期最短,发育速率最快。

表1  虎纹捕鸟蛛在不同温、湿度下各蛛态历期(略)

2.2 发育起点温度和有效积温

计算虎纹捕鸟蛛卵、幼蛛和全世代发育起点温度和有效积温,见表2。

表2 虎纹捕鸟蛛各蛛态发育起点温度(P )和有效积温(K)(略)

3 结 论

生物体的发育是在高于0℃的某一特定温度时才能开始进行,而在其完成生长发育过程中,必须从外界摄取一定的热量完成生长发育所需的总热量,这是动物的基本生物学特性。研究虎纹捕鸟蛛发育起点温度和有效积温,在于为人工养殖和开发利用本类珍贵资源提供理论依据。本试验中,温度是影响虎纹捕鸟蛛发育的主要因子,湿度对虎纹捕鸟蛛历期和幼蛛历期有显著影响。然而,由于虎纹捕鸟蛛在自然变温条件下比在恒温时发育更快,所以自然条件下与恒温试验时结果之间存在一定差异,但室内试验结果仍具有重要的参考价值。

 

 

七. 虎纹捕鸟蛛毒素提取的研究

 

摘要:为探索提取广西产虎纹捕鸟蛛(Selenocosmiahuwena)毒素的新方法,选取雌性虎纹捕鸟蛛225只,根据提取方法(直接咬软管法、直接咬瓶法、激怒咬渐法激怒咬瓶冲洗法)分为4组,结果表明,采用直接咬软管法提取虎纹捕鸟蛛毒素,平均每只蜘蛛可以获得冻干毒素2.28 mg,与采用直接咬瓶法所获得的2,19 mg没有显著差异(P>0.05)。采用激怒咬瓶冲洗法提取虎纹捕鸟蛛毒素,平均每只蜘蛛可以获得冻干毒素重量明显高于激怒咬瓶法[(3.41±0.40)nag,(2.99±0.35)mg,P<0.05],亦明显高于直接咬软管法和直接咬瓶法。该试

验结果表明,激怒咬瓶冲洗法是一种提取虎纹捕鸟蛛毒素的有效方法。

 

关键词:虎纹捕鸟蛛;蜘蛛;毒素

 

在广西和云南等地的丘陵地带所发现的虎纹捕鸟蛛(Selenocosmia huwena)E1j,是世界上个体最大的蜘蛛之一,雌性体长6~9 cm,步足长6—10 on,步足间距27 CITI,螯肢长约1 cm,坚硬锋利,体重20~30 g,身体多毛,头胸部背面有辐射状斑纹。腹部背面有虎皮状花纹。虎纹捕鸟蛛具有强烈的攻击性,捕食各种小型动物,例如昆虫、鼠、小鸟、小型爬行类、蛙、小蛇等。牛的El鼻被其咬后会导致死亡[ 4。,该蛛是我国目前所发现的个体最

大、单蛛产毒量最高且最具开发和应用价值的穴居毒蛛 。由于蜘蛛毒含量少,较难提取,其研究远不如蛇毒和蝎毒那样广泛深入,国外研究得较多的有黑寡妇蛛(Latrodectus ma~tarts tredecimgunatus) 、南美流浪者蛛(Phoneutria nigriventer) 、澳洲狼

蛛(Lycosa ) 等,国内学者发现,新疆穴居狼蛛(I.ycosa singoriensis)粗毒中有抑菌多肽以及抑制肺腺癌培养细胞生长的组分,对虎纹捕鸟蛛毒进行了部分生物学活性的测定,并对虎纹捕鸟蛛毒素.I突变体K3A.HWTX.I进行了化学合成与生理活性分析,提取虎纹捕鸟蛛毒素及测定毒力。以往提取蜘蛛毒液,多采用将蜘蛛处死后取其毒腺,在常温下进行真空干燥,或用软管束引诱蜘蛛排毒后用注射器抽出,直接冰冻真空干燥,这些方法往往使得蛛毒含杂质较多,生物学活性受到一定影响。本试验对虎纹捕鸟蛛毒素的提取方法进行了研究,报道如下。

 

1 材料与方法

1.1 材料来源

试验用雌陛虎纹捕鸟蛛225只,体长6~9 cm均来自南方蜘蛛养殖研究所养殖基地。

1.2 仪器设备及试剂

磨口瓶、吸管、镊子、烧杯、试管以及微量注射器等,经高温消毒备用;筷子若干,直径为80 cm的大盆1个,洗净后用高锰酸钾消毒;无菌蒸馏水1 000 mL;EBA.12型离心机(德国Hettich公司生产),AIPHA I.5型冷冻真空干燥机(德国生产);称量干燥蛛毒采用的电子自动分析天平(德国生产)。

1.3 虎纹捕鸟蛛毒素的提取方法

1.3.1 直接咬软管法将3~4条长约4 cm、内径为2 rain的透明塑料软管用细线捆成一束,作为引诱物。用长镊子将虎纹捕鸟蛛从饲养桶中夹出,一人两手各持一根筷子压住蜘蛛,另一人迅速用拇指、食指抓握住蜘蛛的第2步足与第3步足的交界处,蜘蛛便将螯爪张开,这时将软管束置于螯爪之下,蜘蛛就将螯爪有力地刺入软管内射出毒液。经过反复引诱射毒后,小心地抽出软管束,用微量注射器将其中的毒液抽出,收集于试管中。

1.3.2 直接咬瓶法 抓握蜘蛛同直接咬软管法。在蜘蛛螯爪张开时,将螯爪放入磨口瓶口,

让蜘蛛咬住瓶沿内侧,稍微用力抓紧蜘蛛,蜘蛛即排出毒液,毒液顺瓶口流入瓶内。

1.3.3 激怒咬瓶法操作时一般应戴上帆布手套,以免被虎纹捕鸟蛛咬、抓伤,用长镊子将虎纹捕鸟蛛从饲养桶中夹出,放进直径为80 cm的大盆子中,用筷子撩拨、逗弄蜘蛛,刺激蜘蛛发怒。一人两手各持一根筷子压住蜘蛛,另外一人一只手持磨口瓶,另一只手迅速用拇指、食指捏住蜘蛛的第2与第3步足的交界处,将螯肢端部(螯爪)放进瓶口,让蜘蛛咬住瓶沿内侧,稍微用力捏紧,蜘蛛即排出毒液,毒液顺瓶口流入瓶内。

1.3.4 激怒咬瓶冲洗法 抓握蜘蛛、激怒蜘蛛以及让蜘蛛咬瓶同本文“1。3。3”方法。当蜘蛛排出毒液,毒液顺瓶口流入瓶内之后,用吸管吸无菌蒸馏水反复冲洗3~4次螯爪,将残留在螯爪毒液洗脱下去。

1.4 毒液的干燥

把提取出来的毒液放入冰壶,及时拿到实验室处理。用离心机在3 000 r/rain下离心5 min,取上清液,合并沉淀物,加少量无菌蒸馏水,洗涤,再离心,取上清液,合并上清液,放入冰箱冷冻室。待上清液冻结成冰块后,取出,迅速放入冷冻真空干燥机内,开机。冷冻真空干燥后的蛛毒呈灰白色结晶,用电子自动分析天平称量,记录干毒的重量。干毒置于一20℃冰箱中保存备用。

1.5 统计分析

所得数据使用SPSS统计软件进行One.WayANOVA方差分析。

 

2 结 果

用于提取毒素的虎纹捕鸟蛛,有强烈的攻击性。在将透明塑料软管置于虎纹捕鸟蛛螯爪下

时,螯爪迅速而有力地刺入软管内,然后射出毒液。把虎纹捕鸟蛛放人大盆子中,当用筷子撩拨、逗弄蜘蛛时,发现虎纹捕鸟蛛性情凶猛,非常恼怒,用第3、第4步足以及腹部后端支撑身体,头胸部向上昂起,舞动第3、第4步足、脚须和螯肢,不断地向刺激源进行攻击。当把螯爪放进瓶口时,蜘蛛就咬住瓶沿内侧排出毒液。这时尚有一些毒液残留在螯爪端部、毒腺管口裂缝中,用蒸馏水可以将残留的毒液冲洗入瓶内。经过冷冻真空干燥后的虎纹捕鸟蛛毒素呈灰白色结晶,微黄。采用直接咬软管法提取虎纹捕鸟蛛毒素,平均每只蜘蛛可以获得冻干毒索2。28 ,与采用直接咬瓶法所获得的2。19 没有显著差异(P>0。05)。采用激怒咬瓶冲洗法提取虎纹捕鸟蛛毒素,平均每只蜘蛛可以获得冻干毒素重量明显高

于激怒咬瓶法[(3.41±0.40)嘴,(2.99±0.35)mg,P<0.05],亦明显高于直接咬软管法和直接咬瓶法。可见,激怒咬瓶冲洗法是一种提取虎纹捕鸟蛛毒素的有效方法(见表1)。

表1 不同提取方法对虎纹捕鸟蛛毒素提取重量的影响(略)

 

3 讨论

在采用直接咬软管法提取毒素的时候,确定把软管束放在螯爪之下的时机和置于位置很重

要,如果放得过早、过晚或者位置不对,蜘蛛的螯爪就会咬(蛰)在外侧,没有刺进软管束内,使蜘蛛射出的毒素得不到收集。因此当蜘蛛将螯爪张开的时候,需迅速将软管束置于螯爪之下,蜘蛛就将螯爪有力地刺人软管内,射出毒液。蜘蛛螯爪射出毒液的时间有时同步,要经过反复引诱射毒后,才能获得更多的毒液。梁宋平等[12j采集了虎纹捕鸟蛛的毒液(但没有经过离心这一步),其结果与笔者基本一致。直接咬瓶法的操作过程与直接咬软管法基本一致,只是用磨口瓶替换了软管束,这两种方法平均每只虎纹捕鸟蛛所获得的冻干毒素没有显著差异(P>0.05)。笔者对虎纹捕鸟蛛进行野外观察,发现蜘蛛在防卫和攻击的时候,被激怒后性情变得非常凶猛,这时射出的毒液很多。因此笔者在本试验中设计了一个“激怒”的过程,即通过用筷子不断地撩拨和逗弄蜘蛛,刺激蜘蛛发怒。虎纹捕鸟蛛发怒时,用第3、第4步足支撑身体,腹部着地,头胸部向上翘起,迅速向刺激物猛扑、攻击,一旦触肢、第1和第2步足抓住物体,螯爪就迅速刺入,射出毒素。从本试验可以看出,经过激怒的激怒咬瓶法和激怒咬瓶冲洗法所提取得到虎纹捕鸟蛛毒素明显多于没有经过激怒的直接咬软管法和直接咬瓶法(P<0.05)。虎纹捕鸟蛛射出毒素后,往往在螯爪端部、毒腺管口裂缝中残留一些毒液,因此用蒸馏水冲洗,可以增加部分毒素。蜘蛛毒素的提取是一个很棘手的问题。由于蛛毒难以获得,研究蛛毒的进展非常缓慢,笔者总结的蜘蛛毒素提取方法,操作较为简单,所获得的毒量较大,而且杂质较少,这为今后对蛛毒的研究和开发利用提供了一个良好的基础。

 

 

八. 虎纹捕鸟蛛毒效的实验观察

 

摘要:虎纹捕鸟蛛是一种大型蜘蛛。在我国主要分布在长江以南地区。为了验证其螫牙射出的汁液的毒效.用家兔做实验结果表明:一只成年虎纹捕鸟蛛一次射出的毒液,经15分钟左右,能杀死一只成年家兔。毒液能使静脉血管扩张,使呼吸和心脏搏动先加快、后减慢;呼吸停止.心脏搏动停止。家兔死亡后,全身软绵绵的。

 

关键词:虎纹捕鸟蛛;呼吸频率;毒效 ;毒液

 

虎纹捕鸟蛛(Selenocosmia huwena)属蛛形纲(Arachnida)、捕鸟蛛科(Theraphosidae)。体长印-90mm,重约30-50g。捕鸟蛛主要生活在澳洲、南美洲、印度尼西亚等热带和亚热带

地区,我国云南、广西、湖南、四川等地已有发现。据报道,虎纹捕鸟蛛分泌的汁液有一定的药用价值? 。笔者于1998年1O月6日,对其毒效进行了实验观察,现将实验过程和结果报

道如下:

 

1 实验方法和材料

1.1 方法让虎纹捕鸟蛛刺咬家兔,观察家兔的生理变化。

1.2 材料

(1)虎纹捕鸟蛛:南方蜘蛛养殖研究所饲养的健康、生活2年左右的虎纹捕鸟蛛。虎纹捕鸟蛛甲(以下简称甲蛛),体长约75mm、重约31g、雌性;虎纹捕鸟蛛乙(以下简称乙蛛),体长约72mm、重约26g、雌性。

(2)家兔:笔者饲养的健康雌性家兔1只、白色、短毛、重约2.35妇,年龄8个月左右。

 

2 实验步骤

2.1 把家兔捆住四肢。取甲蛛,让其螫牙刺咬家兔左侧耳朵,刺咬处离耳朵边缘和耳朵尖端各约lm'n。待注入汁液后.急速取下甲蛛。松开家兔四肢,放回兔笼中观察.

2.2 40分钟后,把被咬伤的家兔再次从笼中取出,捆住四肢。让乙蛛刺咬家兔同侧(左侧)耳朵较大血管处。此次刺咬处,离耳朵边缘1.5cm左右,离耳朵尖端2cm左右。注入汁液

后,急速取下乙蛛。再次给家兔松开四肢,放在院中观察。

 

3 观察结果

3.1 第一次捆缚家兔时,其四肢乱蹬乱挠,剧烈挣扎、强劲有力。家兔的呼吸频率、心脏搏动稍有加快。当人将家兔耳朵触及蜘蛛口器时,蜘蛛的螯牙迅速刺人兔耳组织中并注入无色透明汁液。3~4秒后,蜘蛛的螯牙松开兔耳。蜘蛛刺咬兔耳时,家兔剧烈活动四肢和躯体人必须用力按住家兔的四肢和头部蜘蛛螫牙射出的汁液只有一半左右进入兔耳组织中,一半留在外面;射出汁液的0.02~0.03ml。家兔被蜘蛛刺咬后1分钟左右,其呼吸频率明显加快,每分钟约240次;心脏搏动也加快,每分钟约200次。5分钟左右,呼吸频率、心脏搏动仍然很快;左侧眼睛表现有些呆滞;被刺咬处的血管变红、变粗。8分钟左右,呼吸频率、心脏搏动仍然很快;被刺咬处的毛和没进入兔耳朵组织的汁液粘结在一块,呈黄色粘块;血管变得更粗,血液呈紫黑色。13分钟左右,呼吸频率、心脏搏动开始逐渐变慢;左侧眼睛呆滞加重、瞳孔有些散大,但跟脸仍能闭合和睁开;右侧眼睛仍正常;四肢活动还自如。40分钟左右,家兔的呼吸频率、心脏搏动仍高于正常状态;左侧跟睛更加呆滞,右侧眼睛也出现呆滞。

3.2 家兔第二次被捆缚四肢时,其四肢挣扎力量明显减小,只蹬了两下后腿。乙蛛刺咬家兔时,其射出汁液和甲蛛相同,也约0.02~0.03ml,也有一半没进入兔耳朵组织中,约0.01~0.015ml。乙蛛刺咬时,家兔的四肢和躯体肌肉只收缩了几次,没再进入剧烈挣扎。

乙蛛刺咬后,家兔仍能蹲卧,但不再活动;家兔的呼吸频率、心脏搏动没再出现明显加快。刺咬后约5分钟,家兔左、右眼神都明显淡漠,失去光泽;面部失去抽动和表情。10分钟左右,家兔颈部肌肉首先失去支撑力,头触地;接着四肢也失去张力,不能蹲卧,躯体倒地;倒地后,胸腹部剧烈抽动呼吸5次,呼吸停止。14分钟左右,家兔心脏搏动停止,接着瞳孔完全散大。家兔的心脏停止搏动后,15分钟左右体温尚存;半小时后,握住兔耳,提起死家兔,约有lOOml的尿液由死家兔尿道自然流出。

 

4 小结

4.1 虎纹捕鸟蛛螯牙射出的汁液有剧毒。一只成年虎纹捕鸟蛛一次射出毒液约0.02~

0.03ml,这些毒液如完全发挥效力,在15分钟左右能杀死一只成年家兔。

4.2 虎纹捕鸟蛛射出的毒液,作用于哺乳动物,能使静脉血管扩张;使神经系统麻痹;先使呼吸频率、心脏搏动都加快,随后使呼吸频率、心脏搏动都减慢;先使呼吸停止,后使心脏搏动停止,机体死亡。

4.3 虎纹捕鸟蛛射出的毒液作用于哺乳动物,最终能使骨骼肌和平滑肌都舒张。

 

 

九. 虎纹捕鸟蛛雌蛛粗毒毛细管区带电泳分离分析

 

摘要:采用毛细管区带电泳(Capillary Zone Electrophoresis,简称CZE)模式+以虎纹捕鸟蛛(Selenocosmia^舶岫 )雌蛛粗毒为样品进行电泳分离分析.对电泳缓冲溶液的pH 浓度以及有机试剂和两性离子添加剂的加入对粗毒分离的影响作了研究.结果表明,粗毒在pHI1、5,75mmol/L的磷酸盐缓冲液中可以得到最佳的分离.两性离子添加荆(三甲基氨基丙磺酸)能明显改善分离效果;并在实验中确定了虎纹毒索一I(Huwentoxin—I,简称HWTX.I)和虎纹凝集索_1(Sdenocosmlahuwena leefin—like peptide-I,简称SHLP-I)在粗毒电泳图谱中的位置.

关键词 : 虎纹捕鸟蛛; 雌蛛粗毒; 毛细管区带电泳;

 

毛细管区带电泳是一种快速、高效、微量的新型分析技术、1987年Hjerton 首次提出在高

电场强度,3 mill内径的毛细管内作自由溶液的毛细管区带电泳.CZE是毛细管电泳中最为广泛应用的一种模式,是根据样品分子的淌度差异,即迁移速度与电场强度之比的差异进行分离,对蛋白质多肽分子而言淌度差异与其荷质比差异有关.虎纹捕鸟蛛雌蛛粗毒含有多种不同生物学活性的分子口].通过高效液相色谱技术从粗毒中分离纯化出多种成分:HWTX—I 是一种含33个残基,能使小鼠呼吸迅速麻痹致死的神经毒;SHLP—I[5 是一种含32个残基的具凝集活性的多肽;成份中也有分子量较大的蛋白质如透明质酸酶[”等.为了建立一种快速夏敏的虎纹捕鸟蛛雌蛛粗毒分离分析方法,我们采用CZE模式,对虎纹捕鸟蛛雌蛛粗毒进行毛细管电讨:分离,并对分离条件进行了探索.

 

1 材料与方法

1.1 材料

虎蚊捕鸟蛛雌蛛采自广西宁明县,本研究室人工饲养.采集的粗毒玲冻干燥,于-20~保

存,电泳时加双蒸水配成5 mg/ml的浓度.

1.2 试I}I

AccuPur Z1试剂(Trimethyhmmonium propyl sulfonate,三甲基氨基丙磺酸)购自MiUi—

pore公司,其余化学试剂均为AR级.

1.3 仪器

美国Millipore公司Waters Quarita 4000E毛细管电泳仪,紫外检测器(254 nm),O~3O kV

正电源;75 pm ID.未经涂层处理的石英毛细管(购自河北省永年光导纤维厂),使用前分别用0.5 mol/L和0.1 mol/L的NaOH溶液与双蒸水清洗}电讨:时在阴阳两极储液槽中分别加入约l7 m1电泳缓冲液,设置工作电压.进样时间和分离时间等参数,采用流体动力学进样方式,CDMC一2A色谱数据处理机 ;记录实验数据.pHS一25酸度计(上海雷磁仪器厂).

1.4 方法

1.4.1 电泳缓冲液pH对粗毒分离的影响

分别配置pH 2.0的磷酸溶液,pH 5.O的乙酸缓冲液、pH 7.0的磷酸缓冲液、pH 9的硼酸缓冲液、pH l1.0的磷酸缓冲液,浓度均为50 retool/L.

1.4.2 电泳缓冲液浓度对粗毒分离的影响 

配置pH l1.5,浓度分别为25,5O,75mmol/L的磷酸缓冲液.

1.4.3 有机试剂对粗毒分离的影响

50mmol/L的磷酸电泳缓冲液中分别加入5 和10 的乙腈.

1.4.4 两性离子添加剂对粗毒分离的影响

1 mol/L Zl试剂加入pH 7.0,50 mmol/L的磷酸缓冲液和pH 9,50mmol/L的硼酸缓冲液,以未加zl试剂的缓冲液作对照.所有电泳缓冲液,清洗用NaOH溶液和双蒸水经0.45m膜抽滤,电泳前脱气备用.

 

2 结果

2.1 电泳缓冲液pH对粗毒分离的影响

在相同的缓冲液浓度下,粗毒在pH 11时出峰数目大致有22个,峰形尖锐对称,pH 7时出峰数目最少,仅2个;其他pH下大致有9个(图1).进一步重复实验发现,将pH11提高至pH 11.2时,可以得到更好的效果.

2.2 电泳缓冲液浓度对粗毒分离的影响

雌蛛粗毒在pH 11.5,浓度分别为25,5O,75 mmol/L的磷酸盐缓冲液中的电泳分离见图2.随浓度增加,相同电压下电流增大,焦耳热增大,组分迁移速度下降,迁移时间延长,组分峰之间的时间间隔拉长,分辨率提高,分离效果得到改善.由于在75 mmol/L时的电流已达到131 A,所以没有进一步提高缓冲液浓度,以免电泳过程中仪器出现错误信号而不能完成,并且过量焦耳热将导致区带展宽,分离效果下降.

2.3 有机试剂对粗毒分离的影响

在pH 11,50 mmol/L的磷酸缓冲液中,当乙腈浓度达到10 时,能把粗毒电泳图谱的最后一峰分成2个,见图3.实验中观察到,只有当乙腈浓度达到10 时.才能使最后一峰分开.当第二次电泳分离时,由于乙腈的蒸发而不能达到上述效果.浓度为5 时.也不能分开.

2.4 两性离子添加剂对分离的影响

在pH 7和pH 9时,zl试剂的加入提高了峰面积回收率.pH 9时,出峰数目略有增加.两性离子能阻碍蛋白质多肽类与管壁吸附位点的作用,改善分离效果,并且不增加溶液导电性而产生过量焦耳热.

2.5 HWTX—I和SHLP—I峰的位置判断实验

2.5.1 迁移时间定位法粗毒中A,B两峰迁移时间分别为8.28 min和10.02 min,而

HWTX—I和SHLP I纯品的迁移时间分别为8.28 min和lo.11 min,与A,B两峰非常吻合.

2.5.2 标准加入法在粗毒中分别加入HWTX—I或SHLP I进行比较(图4).加入HWTX—I后 图谱中A峰面积明显增大;加入SHLP—I后,B峰面积明显增大,其他组分峰面积没有明显变化.

上述两种方法证明雌蛛粗毒电泳图谱中A峰为HWTX.I,B峰为SHLP—I.

 

3 讨论

3,1 电泳缓冲液pH对分离的影响

分离选择性取决于溶质迁移率差异,CZE迁移率又与溶质所带电荷、大小、形状等有关[ ,而溶质带电情况又直接决定于缓冲液的pH.pH>3时,毛细管内壁硅醇基团解离带负电荷 ],与粗毒中带有正电荷区域的组分发生静电吸附作用,造成峰形拖尾,甚至不能出峰.在pH 11以上的偏碱性缓冲液中,蛋白质和多肽去质子化带负电荷,消除吸附,改善分离,采用偏酸性的电泳缓冲液时,由于蛋白质带正电荷而管壁几乎不带电荷,所以也能抑制吸附有利分

离 ,但粗毒在pH 2,甚至pH1.8时的分离效果都不及pH 11.这是因为粗毒中的组分完全质子化消除了不同组分之间的电荷差异,而使得荷质比相近的组分难以分开,从而降低了分离的选择性.虽然pH 11时分离效果较好,但同样粗毒中的某些组分完全去质子化,消除了电荷差异使得某些组分不能分开.乙腈的加入改变了样品分子中的疏水性,而使最后一个峰分开为两个.

3.2 分离的重复性

图3 有机试剂对粗毒分离的影响

电泳缓冲液:oH 11,50 mmol/L的酸缓冲液.古10 己睛,其余同图2c分别加入经HPLC提纯的HWTX I及SHLP I:进样时间:40 s,其余同图2.

图4 HWTXI和SHLP·I的定位

电泳缓冲液:oH 11.5,。75mmol,L的磷酸缓冲渣,样品均为2.5mg/ml的粗毒,其中图b粗毒在pH 11.5,75 iTtmol/L的磷酸缓冲液中的分离得到了较好的重复性,见附表.HWTX I和SHLP I峰的迁移时间的相对标准偏差分别为1.7 ,2 ,当采用相对迁移时间时,所得相对标准偏差25 C.进样量恒定,并在分离后替换两极缓冲液,可以得到较好的重复性.

 

 

十. 虎纹捕鸟蛛(Selenocosimia huwena)对蟾蜍神经肌肉接头传递的影响

 

摘要:lOmg/ml虎纹捕鸟蛛粗毒对蟾蜍坐骨神经肌肉标本有阻遏作作,1 X 10 g/ml粗毒发生阻断的时间为38rnin,但不改变神经干动作电位,不影响肌肉对直接刺激的反应.阻断后肌内对间接强直刺激仍可发生强直收缩;粗毒对蟾蜍坐骨神经肌肉标本的阻断作甩表现为初期4~50秒的收缩增强继而转向抑制}粗毒可对抗箭毒的阻断作甩}蟾蜍在体坐骨神经肌内标本可被粗毒阻断,但阻断后可以恢复}粗毒不改变蛙腹直肌对Ach的敏感性.粗毒中含有拟胆碱成份.箭毒可 阻止粗毒对蛙腹直肌的拽胆碱效应;该粗毒对蟾蜍坐骨神经肌内标本的阻遏作用发生在神经肌肉接头,粗毒中含有拟胆碱组份,此组份可能通过后膜去极化阻断神经肌内接头.

关键词: 虎纹捕鸟蛛;粗毒; 蟾蜍; 坐骨神经肌肉

 

由于蜘蛛毒含量少,采集较困难,其研究不如蛇毒和蝎毒那样广泛深入,国外研究较早的

主要是黑寡妇蛛.Longenecker(19705[13发现黑寡妇蛛(Latrodectus mactanstredecimguttatus)毒(BWSV)能引起蛙的微终板电位(mEPP)大大增加,并使突触小泡大量释放,引起突触传递的阻断.Grasso(1967,1976)[2 在龙虾牵张感觉神经元上观察BWSV的作用与对蜚蠊的效应一致,Paggi(1971)L{ 认为BWSV可降低鼠脑神经结后电位,阻断不可逆.在漏斗蛛(Atraxrobustus和Agelenopsis aperta)(Skinner等,1989;Brown等,1988)[ ”与平甲蛛(Lo.z~scelesrecalusa)(Jong等,19795口 毒素中也发现多种酶类以及对哺乳动物及昆虫神经系统选择性作用的一些毒素,Adams(1989,1991) 发现漏斗蛛毒中有突触前膜兴奋和后膜抑制作用组分,且影响ca 通道,Lin(1990)口 、Llinans(1989)L1”证实漏斗蛛毒有阻止ca 通道的作用,Shimazaki(1989,1990,1992)m叫¨、Himi(1990)L1 “ Arague(1992) ‘ 等研究表明蛛毒可阻断谷氨酸受体,并且影响记忆功能,现已用于分离谷氨酸能受体,我国学者徐科(1986)Ll 观察到穴居狼蛛(Lycosa singoriensis)毒对螯虾兴奋性接头电位有阻遏作用,徐科(1989)Ll”还对毒液中一个抗菌多肽进行了鉴定和纯化,梁宋平等(1993)对新近发现的虎纹捕鸟蛛(王家福,19925 粗毒进行了生物活性鉴定,发现粗毒中存在阻断神经肌肉接头传递的活性成份,陈群等(1992)等。 认为该粗毒对小鼠膈神经膈肌有不可逆阻断作用,但不影响其微终板电位 本文报道虎纹捕鸟蛛粗毒对蟾蜍神经肌肉接头的阻断作用和阻断机制的初步分析结果.

 

1 材料和方法

1.1 虎纹捕鸟蛛粗毒

蜘蛛毒液的采集和粗毒干粉的制备按前文0 所述方法进行,实验时用任氏液配成lpg/

备用.

1.2 动物材料

螗蜍和青蛙20~45g,采本地采集或收购.

1.3 标本及方法

l_3.1 坐骨神经腓肠肌其制备参见一般生理学实验指导.自制装有若干有机玻璃薄片分隔

成七个小室的神经肌肉槽,隔板上缘中央均开一小缺口备神经通过,肌槽一侧为两个刺激小

室,接着分别是神经加毒室、两个动作电位引导室、肌肉标本室,在电位引导室之间设有一蔗糖间隙室,刺激室、电位引导室和肌肉标本室均装有铂金电极,接地电极在第二刺激小中,装好标本后用凡士林密封缺口,除蔗糖间隙室加纯蔗糖等渗溶液外,其余小室均加上一定量的任氏液浸满标本,肌肉标本室一般加任氏液lm1.刺激器(JSD一731一C)经隔离器(JSD一731一G)后由刺激室的两个电极刺激坐骨神经(或由肌肉标本室两个电极直接刺激肌肉),刺激强度为最大刺激再加其l5 ,引导电极经放大器(FZG一81)送示波器(SBR—1)观察神经干动作电位,同时根据动作电位的变化测量神经干的阈刺激与最大刺激,肌肉收缩通过肌肉标本室-d,滑轮经张力挟能器(JH—IB—lOO或YL一1)送二道生理记录仪(LMS一2B)记录,记录一定时间正常收缩曲线后,抽干神经加毒室和肌肉标本室内的任氏液,再分别加上含一定浓度蛛毒的任氏液,加蛛

毒后不时用注射器从肌腱端吸取溶液润洗接头端。肌肉收缩发生阻断前后观察神经干动作电

位的变化,阻断后观察肌肉对直接刺激与间接强直刺激的反应.

1.3.2 运动终板实验口螗蜍毁髓后分离两侧坐骨神经和腓肠肌肌腱,剪断肌腱并系线扎

紧备记录肌肉收缩用,将右侧股动脉结扎,把右侧除坐骨神经外股部其它组织结扎,将四肢趾端固定,插入蛙胸淋巴囊注射用针头,用两台刺激器(附隔离器)分别刺激两侧坐骨神经.用二道生理记录仪同时记录两侧肌肉的收缩.记录一段时间正常收缩曲线后,从胸淋巴囊注入一定浓度蛛毒的任氏液0.1~0.2m1.当阻断发生后,直接婀激肌肉,观察肌肉的收缩反应.

1.3.3 蛙腹直肌实验将青蛙腹直肌标本置于室温下通以空气的任氏液浴槽中,标本一

端固定在 L”通气钩上,另一端系线经换能器记录蛙腹直肌的收缩反应,张力负荷l昏灌流液5~ 10ml,但由于毒索较少改用自制小麦氏浴皿灌流,灌流液3ml,观察蛙腹直肌对不同浓度溴化乙酰胆碱的反应,及蛛毒对蛙腹直肌的影响.

 

2 实验结果

2.1 虎纹捕鸟蛛粗毒对离体坐骨神经腓肠肌标本坐骨神经干动作电位及肌肉收缩的影响

2.1.1 肌肉正常收缩曲线加任氏液模拟加毒和灌流过程,长时间观察肌肉对间接刺激的反

应(n=5),一般标本以5秒1次持续刺激尚可维持4小时正常收缩,如图l所示.在肌槽内抽取任氏液时可见基线上移,而加上任氏液基线则回到正常水平,这是由于标本的浮力变化造成的.

图1 正常肌肉收缩曲线(略)

2.1.2 蜘蛛粗毒对神经肌肉传递的阻遏作用 10 ~10 g/ml蛛毒均可明显对神经肌肉传

递产生阻遏作用(n=10),10。mg/ml蛛毒造成传递完全阻断的时间平均为38±4.2min,7×10-{g/ral则需5O±7.1min.肌槽内加蛛毒初期明显可见基线上移,且收缩力量增强,从正常肌肉收缩可见蛛毒引起的基线上移和收缩力量增强,绝不是由于加蛛毒后肌肉浮力变化所致,蛛毒引起肌肉收缩加强维持4~50秒后,转向收缩力逐渐降低,最后导致肌肉收缩阻遏,此时如果直接刺激肌肉,仍可见肌肉能正常收缩,间接强直刺激神经,肌肉也能发生强直收缩,且强直收缩能够维持,图2示两例标本的阻断过程,虽然神经加毒室蛛毒的浓度与肌肉标本室一样,但加毒前与发生阻断后神经干动作电位无显著差异.用5.0×10 g/ml的筒箭毒作用神经肌肉标本,肌肉收缩逐步减弱未见基线上移和肌张力增强的现象,如图3所示两例标本.

如果配制5.0×10 g/ml箭毒与1.0×10 g/ml蛛毒的混合液,则所需阻断时间明显延

长,图4示一例实验结果,该实验插在图3两例实验之间,箭毒系同一母液所配,实验在同一天完成.

图2 蜘蜱粗毒对神经肌肉接头的阻遏作用(略)

图3 箭毒对神蛀肌由的阻遏作用(略)

图4 箭毒与蛛毒混合液对神经肌肉的影响(略)

2.2 蜘蛛粗毒对在体运动终板的影响

蛙胸淋巴囊注入粗毒后,右侧(阻断血液循环侧)坐骨神经腓肠肌仍能正常收缩,左侧(未

阻断循环侧)坐骨神经腓肠肌经过一定时间后肌肉收缩阻遏(n=3),蛛毒浓度高,发生阻断作用较快,发生阻断效应后经一定时间有自动恢复肌肉收缩现象,再经一段时间又转向抑制,见表1与图5.

附表蜘蛛粗毒对运动终板的影响(略)

图5 蜘蜱粗毒对运动雎板的彰响(略)

2.3 蜘蛛粗毒对蛙腹直肌的影响

2.3 1 蛙腹直肌对Ach的敏感性Ach浓度在l×10 ~8×10“g/ml之间其对数值与蛙腹直肌的收缩力量(g)呈线性关系,如图6所示,但每例标本由于个体差异,直线可能左移或右移.

2.3.2 蜘蛛粗毒的效应蛛毒浓度在l0 ~10 g/ml之间(n一10)对蛙腹直肌收缩无影响,且不影响蛙腹直肌对Ach的敏感性.蛛毒在10-5~10 g/ml之间(n一7)均可见蛙腹直肌收缩.10 g/ml作用更加明显,但也不影响蛙腹直肌对Ach的敏感性,在10-‘g/ml蛛毒的基础上加Ach,可见蛙腹直肌收缩累加(见图7).

当蛙腹直肌加筒箭毒(io ~i0~g/m1),可见箭毒不引起蛙腹直肌收缩,但明显降低肌肉

对Ach的敏感性,需经多次灌流后其敏感性可恢复,当加入银环蛇毒时(10 g/m[),肌肉对蛙腹直肌的影响.

图6 溴化乙酰胆碱对蛙腹直肌的影响(略)

图7 蜘蝽粗毒对蛙懂直肌的影响(略)

圉8 箭毒、银环蛇毒素及粗毒对蛙腹直肌的影响(略)

 

3 分析讨论

虎纹捕乌蛛粗毒对坐骨神经肌肉发生阻遏后.神经干动作电位无变化,且肌肉对直接刺激有反应,说明粗毒发生的阻断部位在神经肌肉接头.粗毒对神经肌肉传递阻断作用的显著特点是加毒初期收缩力量显著加强且朝向收缩期发展再转向抑制,这与后膜非去极化型阻断剂箭需毒的阻断表现明显不同,同时粗毒对箭毒的阻断有拮抗作用,表明粗毒开始有加强突触活动的过程,粗毒中含非去极化型组份可能性较小,粗毒不改变蛙腹直肌对Ach的敏感性,且粗毒具有拟胆碱组份,它能与箭毒发生对抗作用,强直刺激坐骨神经雕肠肌标本可以发生强直和维持强直收缩,这也属于去极化型阻断的一个特征.因此粗毒中可能有组份通过拟胆碱作用对后膜造成去极化型阻断,但并不能完全排除粗毒对胆碱酯酶的影响.在我们以前的研究中发现小白鼠经腹腔注入粗毒后有喘息、蜷伏、动作失调、抽搐、死亡后眼球突出等症状,这与箭毒的松驰型麻痹相对照,也说明粗毒中有去极化型阻断的可能性,研究中还发现粗毒无胆碱酯酶的活性,这与粗毒中含有拟胆碱成份的假设是一致的,在一种毒素中不可能有相互拮抗或降解自身的组份,这也可以解释粗毒对蟾蜍在体标本阻断过程中的恢复作用.

综上所述,粗毒中可能含有拟胆碱组份,此组份可能通过后膜去极化阻断神经肌肉接头.

 

 

十一. 虎纹捕鸟蛛毒素一I对全脑缺血再灌损伤大鼠海马组织中TNF凋亡通路的影响

 

摘要: 目的:探讨注射虎纹捕鸟蛛毒素一I(HWTX~I)对全脑缺血模型大鼠神经保护作用的可能分子机制。方法:48只SD大鼠随机分为假手术组、非用药组和用药组,采用改良的Pulsinelli大鼠四血管阻断全脑缺血结合蛛网膜下腔置管模型,应用光镜、免疫组化方法观察各组大鼠海马CA1区锥体细胞Nissl染色形态学变化及海马组织中肿瘤坏死因子a(TNFa)、肿瘤坏死因子受体I(TNFRI)、TNF相关死亡结构域(TRADD)、Fas相关死亡结构域(FADD)、Caspase8等TNF凋亡通路相关因子蛋白表达水平的变化。结果:(1)用药组大鼠锥体神经元排列较整齐,略为疏散分布,而非用药组大鼠锥体神经元排列散乱,层次不完整,稀疏分布;(2)TNFa、TNFRI、TRADD、FADD、Caspase8阳性单位的表达值以非用药组最高,用药组次之,假手术组表达最低。结论:HWTX—I能明显减轻全脑缺血再灌损伤大鼠海马锥体细胞的损伤,并降低大鼠海马组织TNFa、TNFRI、TRADD、FADD、Caspase8蛋白水平表达,表明HWTX~I对全脑缺血再灌损伤大鼠海马神经细胞凋亡具有抑制作用,在一定程度上对全脑缺血再灌损伤有神经细胞保护作用。

 

关键词 :全脑缺血再灌;HWTX—I;TNF凋亡通路;

 

大鼠脑震荡、颅脑损伤是较为严重的创伤性疾病,易造成中枢神经系统的缺血、缺氧,引起神经元凋亡和坏死。细胞内Ca 超载是导致脑神经元损伤的主要原因之一_1],钙离子通道阻断剂能够抑制Ca 内流,因而被广泛应用于缺血性脑神经元的保护研究。虎纹捕鸟蛛毒素一I(HwTX—I)是从我国珍稀蜘蛛—— 虎纹捕鸟蛛(Selenocosmia huwena)粗毒中分离纯化一

种多肽类神经毒素,经离子通道分析技术证明是一种作用于突触前膜的N型钙离子通道阻断剂口],与第一个运用于临床治疗神经性头痛和缺血性脑损伤的多肽类钙拮抗剂_3 芋螺毒素∞一conotoxin,MVIA(合成品SNX—ll1)具有类似的结构模体和相似的生物学功能_4]。在前期工作中,我们进行了HWTX—I对大鼠脑匀浆中自由基浓度[5 及线粒体凋亡通路中Bax、Bclz相关因子基因及蛋白表达变化影响的研究[6],目前此领域国内外鲜有对肿瘤坏死因子(TNF)死亡受体凋亡通路相关因子进行实验研究的报道,故本研究旨在通过观察蛛网膜下腔注HwTX—I后,全脑缺血再灌损伤大鼠海马CA1区锥体细胞Nissl染色形态、海马组织TNF凋亡通路中相关因子蛋白表达水平的变化,从凋亡信号转导通路方面深入探讨HWⅨ 一I对全脑缺血损伤模型大鼠神经细胞的保护作用的可能分子机制,为临床神经细胞保护新药的开发提供理论研究基础。

 

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

5~6周龄健康雄性SD大鼠48只,体重180~250g,由中南大学湘雅医学院实验动物中心提供。大鼠随机分为3组:假手术对照组、非用药组、用药组,每组16只,其中8只用于Nissl染色、另8只用于免疫组化检测。

1.2 仪器、试剂与药品

XSP一8CA型光学显微镜(上海光学仪器六厂);YBL一Ⅲ型生物组织冷冻包埋机(湖北孝感亚光医用电子技术研究所);HM3401型旋转切片机(德国MI—CROM 公司);HI1220型烘片机(上海Leica器材有限公司);Simple PCI专业图像分析系统(美国)。HwTX—I由湖南师范大学蛋白质化学研究室分离纯化,深圳科兴公司制药厂加工成冻干粉针,批号000418,纯度99.5 ,临用前用灭菌生理盐水配制,4℃冰箱保存;甲苯胺蓝由上海化学试剂站分装厂提供;SP一9000免疫组化试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司;肿瘤坏死因子a(TNFa)、肿瘤坏死因子受体I(TNFRI)、TNF相关死亡结构域(TRADD)一抗购自武汉博士德生物工程有限公司;Fas相关死亡结构域(FADD)一抗由Santa Cruz公司提供;

Caspase 8一抗由Cell Science公司提供。其余为常规试剂。

1.3 四血管阻断全脑缺血模型的制作

采用Pulsinelli“四血管阻断”全脑缺血损伤模型_7 结合蛛网膜下腔置管术 ,经适当改进应用于本研究。麻醉大鼠,暴露第一颈椎,烧灼椎动脉。随即进行蛛网膜下腔置管:暴露寰枕后膜,将蛛网膜小心勾一个小孔,插入PE 。管至蛛网膜下腔,进管深度约2cm,外端约留5cm长,埋管,缝合切口。手术24小时后,进行双侧颈总动脉夹闭,约15min后松开动脉夹,缺血再灌72小时。给药途径为经留置的PE 。管注入蛛网膜下腔。假手术组同上手术过程,不烧灼椎动脉,不夹闭,不给药;用药组于颈总动脉夹闭后立即注射HWTX—I(1.Ottg/kg),大鼠缺血再灌3天,每天给药1次,共给药4次;非用药组于夹闭后注入等量生理盐水。

1.4 Nissl染色、免疫组化染色

缺血再灌3天后,大鼠经10 水合氯醛腹腔注射(0.3ml/100g体重)麻醉后,按常规心脏灌注方法进行操作。取出脑组织标本,固定于4 多聚甲醛磷酸缓冲液(0.1M,pH一7.4)中12小时以上,石蜡包埋、组织切片后进行Nissl染色和免疫组化染色,光镜下观察。

1.5 Nissl染色

石蜡切片经二甲苯脱蜡,酒精梯度复水,蒸馏水冲洗后,置于1 甲苯胺蓝(1g甲苯胺蓝:100ml蒸馏水)中40℃染色15min;蒸馏水再次冲洗,70 、80 、95 乙醇洗片,镜下观察;100 乙醇脱水3次,二甲苯透明3次,中性树胶封片。光镜下观察各组大鼠海马CA1区锥体细胞大体形态变化。

1.6 免疫组化染色

染色步骤按ABC法常规进行。第一抗体原液按1:50稀释,光镜下观察免疫组化染色的显色反应,海马组织中出现棕褐色为阳性。假手术组均用0.01MPBS代替一抗,结果为阴性。光镜下观察大鼠海马组织TNFa、TNFRI、TRADD、FADD、Caspase8蛋白的表达。用Simple PCI图像分析系统对免疫组化阳性产物的灰度和面积进行分析,具体步骤为:每张切片在16×40倍镜下选取不相重叠的3个代表性视野(300×1000),测量阳性反应产物的面积和灰度值以及所选区域的平均灰度值。阳性产物的表达用阳性单位表示,以上检测过程均严格按照试剂盒说明书操作。

1.7 统计学处理

实验数据以平均数± 标准差( ± )表示,采用SPSS11.5统计软件进行分析,样本均数比较采用单因素方差分析。P

 

2 结果

2.1 各组大鼠海马CA1区Nissl染色形态学观察

假手术组可见数层锥体神经元,排列整齐紧密(图la)。用药组可见数层锥体神经元,排列较整齐,略为疏散分布(图l)。非用药组可见锥体神经元排列散乱,层次不完整,稀疏分布。

 

图1b 各组大鼠海马CA1区Nissl染色形态学观察(略)

 

2.2 各组大鼠海马CA1区TNFa、TNFRI、TRADD、FADD、Caspase8免疫组织化学染色结果

2.2.1 各指标蛋白表达结果

假手术组海马CA1区几乎未见阳性细胞表达或仅见少量阳性细胞表达;非用药组海马CA1区可见阳性细胞表达且集中密集分布;用药组海马CA1区可见阳性细胞表达,但其分布较非用药组分布稀疏。

2.2.2 计算机显微图像分析结果

由表1可见,TNFa、TRADD阳性单位的表达值以非用药组最高,用药组与假手术组次之,其中非用药组、用药组与假手术组比较差异有统计学意义(P<0.01),用药组与非用药组比较差异亦有统计学意义(P<0.O1)。TNFRI阳性单位的表达值以非用药组最高,用药组稍次之,假手术组最低。其中非用药组、用药组与假手术组比较差异有统计学意义(P<0.01),用药组与非用药组比较,差异虽无统计学意义,但用药组TNFRI的蛋白表达较非用药组呈下降趋

势。FADD、Caspase 8阳性单位的表达值以非用药组最高,用药组与假手术组次之。其中非用药组、用药组与假手术组比较差异有统计学意义(P

表1 各组大鼠海马CA1区TNFa、TNFRI、TRADD、FADD、Caspase8免疫组化蛋白表达分析结果(阳性单位)(略)

 

3 讨论

在前期实验中,我们构建了大鼠全脑缺血再灌损伤结合蛛网膜下腔置管动物模型l-9],并在此模型上应用HWTX—I对大鼠进行蛛网膜下腔注射并检测脑匀浆中SOD、CAT活力及MDA浓的变化l-5]及线粒体凋亡通路中相关因子Bax、Bcl 蛋白及基因的表达 。结果显示HWTX—I能抑制氧自由基的产生及凋亡因子的表达,并促进抗凋亡因子的表达,表明HwTX—I可能具有抗缺血性脑损伤方面的作用。细胞凋亡是生物体细胞受基因精确调控的主动消亡过程,亦是缺血性细胞死亡的重要途径之一,形态学变化是细胞凋亡的基本特征和最终阶段l-1 。本实验结果显示:假手术组大鼠海马CA1区锥体细胞排列整齐紧密;用药组大鼠海马CA1区可见数层锥体神经元,排列较整齐,略为疏散分布;而非用药组可见锥体细胞排列散乱,层次不完整,稀疏分布。因此我们认为HwTX—I蛛网膜下腔注射能维持全脑缺血再灌损伤大鼠海马锥体神经元基本正常形态。目前,一般认为参与缺血性脑损伤细胞凋亡调控的有三条信号转导通路,分别是线粒体通路、死亡受体通路和内质网通路l-1 。其中最典型的死亡受体之一

是TNFRs。TNFa通过TNFRI介导其生物学活性,当与TNFa结合后,TNFRI三聚体化,然后通过DD~DD作用募集一个衔接蛋白TRADD,TRADD作为一个衔接平台,进一步募集其它信号分子FADD、TRAF一2(TNFR— associated factor一2)和RIP(Receptor in—teractive protein)。FADD 通过C 端的DD 与TRADD的DD结合,然后通过N端的死亡效应结构域(DED)与Caspase 8酶原中的类似结构结合,导致Caspases级联反应,诱导细胞凋亡I1幻;而TRAF一2和RIP通过NFxB途径发挥抗凋亡作用。

综上所述,TNFRI涉及到促凋亡及抗凋亡两种截然不同的信号转导途径,究竟TNFRI活化后细胞是生存还是死亡则取决于双方信号水平的强弱对比即时机的不同Il 。Stoll等_1们证实前脑缺血后小胶质细胞释放的神经毒性介质包括TNFa上调,引起继发性脑梗塞;另一方面这些细胞因子又可对抗NMDA介导的信号通路引起的缺血性脑损伤,发挥脑保护作用。Wang等I1 5]认为脑损伤后的早期阶段,TNFa mRNA 的过度表达对损伤的组织有害;而在损伤后的恢复时期,TNFa mRNA的低水平表达则能加速损伤组织的修复过程。本实验结果显示:全脑缺血损伤性再灌3天后,非用药组大鼠海马组织促凋亡因子蛋白表达水平均出现了不同程度的上调,而用HWTX—I蛛网膜下腔治疗性注射后,从起始阶段、中间衔接阶段及凋亡执行阶段,其蛋白表达水平均较非用药组显著下降,表明HwTX—I具有一定的抗神经细胞凋亡作用,在一定程度上可有效保护中枢神经细胞。其作用机制可能是HwTX—I作为一种新型N 型钙通道阻断剂,能有效阻断胞外ca抖的大量内流,使细胞内游离钙降低,减少由于细胞内钙超载而引起的一系列病理损害,从而保护神经细胞,尤其是中枢神经细胞正常的结构与功能。但其

确切作用机制有待进一步深入研究。

 

4 总结

HWTX—I能明显减轻全脑缺血再灌损伤大鼠海马锥体细胞损伤,维持海马锥体神经元基本形态,并降低大鼠海马组织TNF凋亡通路中促凋亡因子TNFa、TNFRI、TRADD、FADD、Caspase8蛋白表达,表明HwTX—I对大鼠全脑缺血再灌海马神经细胞凋亡具有抑制作用,在一定程度上对全脑缺血再灌损伤有神经细胞保护作用。死亡受体介导的信号转导通路与脑缺血再灌损伤密切相关,阐明TNF死亡受体通路在全脑缺血再灌损伤中的作用机制对于有效防治由此造成的中枢神经系统损害具有重要的理论意义,也为其临床治疗提供新的思路和治疗手段。

 

 

十二.虎纹捕鸟蛛毒素一I(HWTX—I)对豚鼠回肠的作用机制研究

 

摘要:虎纹捕鸟蛛毒素HWTX—I(5 rag/L)对电刺激豚鼠回肠引起的一过性收缩有非常明显的抑制作用.HWTX—I的抑制作用发生后,乙酰胆碱(ACh)诱发的回肠收缩幅度与使用HWTX—I前无明显差异.在使用酚簧拉明后,HwTX—I仍能抑制豚鼠回肠的一过性收缩 HwTX—I对脬鼠回肠的抑制作用主要是抑制

 

关键词: 虎纹捕鸟蛛;毒素HWTX—I; 电刺激; 脬鼠回肠; 收缩

 

 

虎纹捕鸟蛛毒素一I(Huwentoxin I,HWTX—I)是虎纹捕鸟蛛毒素的主要成分,约占粗毒

40% ,小鼠LDso为0.7 mg/kg.HWTX—I一级结梅序列已经确定 ],由33个氨基酸组成,相

对分子质量为3750,分子中含有三对二硫键[ ,其空间结梅已通过二维核磁共振方法得到解析 ,特点是有一个由三股反平行的 折叠和三对二硫键形成的折叠模体.然而关于HWTX—I的毒理机制报道甚少.周培爱等认为HWTX—I可能作用于N型乙酰胆碱受体(n—AChR) .本文以M 受体丰富的豚鼠回肠为标本,探讨HWTX—I在非N型乙酰胆碱突触作用的可能性和机理.

 

1 材料与方法

1.1 材料

豚鼠350~500 g左右,购于湖南医科大学实验动物中心,虎纹捕鸟蛛毒素一I由本室按

前发表的方法纯化 ,经HPLC和质谱鉴定为单一组分.ACh、箭毒、酚妥拉明、肾上腺素

均购于Sigma公司. 阿托品为药用注射液.生理溶液为台氏液.

1.2 方法

参考高木敬次郎介绍的方法 ] 杀死豚鼠,立即开腹取出约10 cm长的回肠,置于台氏液中,通以95 的o。和5%CO 的混合气体,分成3段、浴槽容积10 ml,恒温32~38℃.将回肠一端固定于通气钩上,另一端与换能器用细线相连. 电子刺激器(JJC一3,上海国泰电讯器材厂,作者已对其进行改造)刺激频率0.05次/s,波宽0.05 ms,强度25 v.刺激电极为铂金丝,阴极插于肠管内侧,阳极置于肠管外侧的台氏液中.回肠的收缩使用二道生理记录仪描记(LMs一2B,成都仪器厂),标本在台氏液平衡半小时后进行药理学实验.

 

2 实验结果

2.1 HWTX—I对电刺激豚鼠回肠引起的一过性收缩的抑制作用

豚鼠回肠在没有电刺激的条件下有一定节律的小幅度不规则的收缩.施加电刺激后,回

肠则发生与刺激同步的快速而强烈的收缩.浴槽中加入毒素HWTX一1,其终浓度为5 rag/

L,电刺激引起的回肠收缩很’陕明显的被抑制(n一5).温度4o'C,通以空气阻断时间为(2.78

士o.19)rain(n一3),温度32℃ ,通以95 o2和5 CO2阻断时间为(5.17士0.23)min(n一

2),如图1所示.HWTX—I抑制作用发生后通过台氏液灌流,电刺激豚鼠回肠引起的一过性

收缩可以完全恢复,时间约14 rain.

2、2 HWTX—I对乙酰胆碱诱发豚鼠回肠收缩的作用

HWTX—I的抑制作用发生后停止电刺激,浴槽中加入ACh 6/~g/L,ACh能够诱发回肠收缩,其诱发幅度与施加HWTX—I前或HWTX一1抑制作用发生后通过台氏液灌流完全恢复时对同样浓度ACh的反应投有明显差异. 如图2所示.

2.3 阿托品与HWTX-I的作用差异

HWTX一1的抑制作用通过台氏液灌流完全恢复后浴槽中加入硫酸阿托品0.3 mg/L,可见电刺激豚鼠回肠的收缩作用非常迅速地被抑制,抑制作用发生后停止电刺激,浴槽中加台氏液冲诜.

圈1 HWTx—I对脬置回脖收缩的抑制作用(略)

圈2 HWTX4对乙酰胆碱请点脬置回肠收缩的作用(略)

HWTx—I 5 mg/L加入ACh 6 g/L,ACh不能够诱发回肠发生收缩,阿托品的抑制作用即使通过灌流也很难恢复.如图3所示.

2.4 酚妥拉明对Hw'rx-I抑制作用的影响

实验中如果先加入酚妥拉明0.1 mg/L,HWTX—I仍然会抑制电刺激豚鼠回肠引起的阿托品对脬置回肠的抑制作用.

圈3 阿托品对脬置回肠的抑制作用(略)

 

3 讨论

一般认为,按本文实验方法刺激引起豚鼠回肠的一过性收缩主要是刺激了副交感神经节后纤维,使之释放神经递质乙酰胆碱(ACh),引起M 受体兴奋所致 .在我们的实验中,ACh可以诱发回肠收缩,阿托品能阻断ACh诱发的回肠收缩.阿托品也能阻断电刺激回肠引起的一过性收缩,基本说明刺激神经兴奋M受体的观点.虎纹捕鸟蛛毒素HWTX—I对电刺激豚鼠回肠引起的一过性收缩有非常明显的抑制作用.HWTX—I的抑制作用发生后,ACh诱发回肠的收缩幅度与使用HWTX—I前无明显差异.而阿托品对豚鼠回肠的一过性收缩抑制作用比HWTX—I明显要快,但恢复明显慢,ACh不能诱发阿托品作用后的回肠收缩.HWTX—I与阿托品在回肠上明显作用差别提示HWTX—I主要作用部位不在M 受体上.在使用n受体阻断剂酚妥拉明后,HWTX一1仍能引起豚鼠回肠的一过性收缩抑制,另外在蛙心灌流实验中也看不到HWTX-I强心作用,说明HWTX—I不通过激动肾上腺素能受体发生作用.如果通过抑制交感神经递质去甲肾上腺素(NE)释放,理论上豚鼠回肠引起的一过性收缩应该加强,说明毒素的抑制作用在本标本上主要不通过交感神经递质系统进行.HWTX—I对豚鼠回肠的抑制作用不是通过阻断M 受体和兴奋n受体所致,而是抑制ACh释放或影响了ACh释放之前的过程.这样耩们就能解释HWTX—I在小鼠膈神经膈肌上引起的mEPP、EPP的变化和最终导致的阻断效应.至于HWTX—I如何引起神经递质ACh释放减少?有待在细胞分子水平进一步研究.另外,黑寡妇蜘蛛毒素中的一个组分不管对什么动物,也不论何种神经递质,其作用都是使神经传递物质大量释放,造成突触传递阻断.那么HWTX—I是否也同样影响其它神经递质的释放呢?本研究工作正在深入进行中.

 

 

十三. 虎纹捕鸟蛛毒素.I天然突变体的分离纯化与鉴定

 

摘要:通过离子交换及反相HPLC,从虎纹捕鸟蛛粗毒中分离得到一种虎纹毒素一1天然突变体,MALDI—TOF质谱仪分析表明该多肽天然突变体分子量为3 636 Da.EdlTlan测序结合串联质谱和氨基酸组成分析鉴定出该天然突变体的序列为H2N—ACKGV FDACT PGKNE CCPNR VCSDK HKWCK WQ.COOH.其中6个Cys形成3对二硫键.小鼠脑室注射实验表明,该天然突变体能使小鼠致死,但不能阻断小鼠膈神经一膈肌标本的神经肌肉接头传递.本研究结果表明,K32残基对于HWTX—I的生物学活性有关键性作用.

 

关键词: 天然突变体;虎纹捕鸟蛛毒素一I;虎纹捕鸟蛛

 

蜘蛛毒液成分较多,不同种蜘蛛的毒液的成分不同,主要的成分为蛋白质、多肽、多胺类神经毒素、酶、核苷酸、游离氨基酸、单胺以及无机盐等物质,其中以蛋白质和多肽类神经毒素较为重要,它们一般含有多个Cys残基,并形成多对二硫键? .HWTX.I是从虎纹捕鸟蛛(Omithoetonus huwena)粗毒中分离得到的一种多肽类神经毒素,相对分子质量为3 750,等电点为8.95,含有33个氨基酸残基,其序列为H,N.ACKGV FDACTPGKNE CCPNR VCSDK HKWCK WKL.COOH,其中的6个Cys形成3对二硫键.该毒素能可逆地阻断小鼠膈神经膈肌接头传递,对胆碱能和肾上腺素能突触神经递质的释放有抑制作用,是一种N型c 通道阻断剂 ,本文报道 .I的一种天然突变体的分离纯化及其序列分析,并初步鉴定它的生物学活性.

 

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

粗毒用电刺激法采集.虎纹捕鸟蛛采自广西,由本室动物房饲养,昆明种小白鼠(23±3)g由本室动物房提供 色谱纯乙腈(ACN)为湖南化工研究院精细化工研究所产品.异硫氰酸苯酯(PITC)、N一甲基吗啉、三氟乙酸(TFA)、正庚烷、氯代正丁烷、乙酸乙酯等试剂为Applied Biosystems公司产品.V 酶为Siena公司产品.其他试剂均为国产分析纯产品.

1.2 ⅣTx.I天然突变体的分离纯化

HWTX一工天然突变体的分离纯化基本按照本室以前报道的方法进行.

1.3 质谱分析

质谱分析在美国Applied Biosystem公司生产的Voyager—DE—STR质谱仪和美国Bruker公司生产的UhraflexTOF—TOF质谱仪上进行.以HWTX一工(3 750.45 Da)为外标进行校正.

1.4 还原与Cys的碘乙酰胺修饰

取90 txg这种天然突变体溶于90 缓冲液(0.5 mol/L N一甲基吗啉/醋酸,pH 8.3),加入90 mg盐酸胍和1 mg DTF(二硫苏糖醇),溶解混匀,暗室常温下反应4 h;加入2 mg碘乙酰胺,溶解混匀,暗室常温下反应过夜,反相HPLC脱盐纯化.

1.5 氨基酸序列测定

氨基酸序列测定在Applied Biosystem 491型Procise蛋白质测序仪上自动进行.苯异内酰硫脲(哪)氨基酸用哪C18柱在Applied Biosystem的140 C分析仪上进行反相HPLC.

1.6 酶酶解还原碘乙酰胺化样品

取20 txg还原碘乙酰胺化样品溶于40 缓冲液(0.1 mol/L NaH2PO4/Na2HPO4,pH 7.8),加入1 gv 酶,混匀后置于37℃恒温水浴锅中酶解过夜.

1.7 氨基酸组成分析

按参考文献[2]的方法进行,取4根样品水解小管,1,3管分别装入50 p-g HWTX一工,2,4管分别装入25的天然突变化体,置于样品水解瓶中,向水解瓶底部加入200 L 5.7 mol/L重蒸的盐酸,盖上水解瓶盖,抽真空后置于(105±1)℃烘箱内酸水解22 h.PITC衍生后用反相HPLC分析VIE.氨基酸.

1.8 生物学活性测定

脑室注射参照陈蔚云等的方法进行,对照组注射等体积的生理盐水.电生理实验用小鼠的膈神经膈肌标本测定,按Zhou等 的方法进行.

 

2 结果

2.1 ⅣTx.I天然突变体的分离纯化

虎纹捕鸟蛛粗毒的典型离子交换色谱图见图1.保留时间约38 min的峰含虎纹捕鸟蛛毒素.工(HWTX.工)及本研究的目标肽.收集该峰用反相HPLC进行脱盐和进一步分离纯化(图2),收集保留时间为21.50min的峰(*标记)即得本研究的目标肽,进一步的反相HPLC和MALDI.TOF质谱分析证明其为单一多肽.

2.2 相对分子质量和序列测定

修饰前天然突变体的MALDI.TOF质谱分析测得平均相对分子质量( +Ⅳ)为3 637.22 Da(单同位素相对分子质量为3 635.66 Da).还原并用碘乙酰胺修饰后的HWTX.工的天然突变体质谱分析测得平均相对分子质量为3 985.73 Da(图略).修饰前后相差约348Da.NCOCH2.基团的相对分子质量为58 Da,表明分子中有6个Cys加上了nzNCOCH2.基团,同时也提示突变体分子中含有3 x,t-硫键.用Edman降解方法进行变体的序列测定时,前30个循环给出明显的信号,后面的2个信号不明显,故N.端测序结果为:ACKGV FDACT PGKNE CCPNR VCSDK HKWCK?7.鉴于C末端最后个氨基酸残基不确定,故进一步用串联质谱技术来鉴定.先用V 酶酶解还原并碘乙酰胺化后的样品,ACKGVFD ACT PGKNECCPNRVCSD KHKWCK??( 表示V 酶的酶切位点).Uhraflex TOF.TOF质谱鉴定酶解样品时,以其中的1200.23 m/z峰为母离子峰,做lm,得其二级质谱分析图谱(图3).

图1 虎纹捕乌蛛粗毒阳离子交换HPLC图谱(略)

 图2 图1中保留时间为38 min峰的RP-HPLC图谱

 (a)质荷比为1 200,239母离子的MS/MS图谱,标有检测到的b_离子和y一离子系列

(b)c一末太端理论计算的b_离子和y一离子系列

3 C末端肽段的二级质谱图(略)

图3中有完整的b 系列碎片离子和y2.y7碎片离子.由此可推知该突变体c端两个氨基酸残基为. w .K/Q-.由于K和Q残基相对分子质量很接近,直接分析时超出了质谱的分辨能力

,故接着用氨基酸组成分析鉴定K或Q.由于突变体的32个残基的前31个都与HWTX.I的相同,所以, 进行突变体氨基酸组成分析时以HWⅨ-I为对照. 一I和天然突变体氨基酸组成分析的代表性(图略).选取D,E和K平均峰面积(HWⅨ-I 3次测定值平均,突变体5次平均)进行比较,结果见表1,

由于样品在盐酸水解过程中,谷氨酰胺(Q)和天冬酰胺(N)会分别转化为谷氨酸(E)和天冬氨酸(D),根据HWTX.I的已知序列和已经测得突变体的氨基酸残基序列可知,HWTX—I含2个D.2个N,1个E,6个K,不含Q.如果该天然突变体与Hw rX—I的前32个残基序列完全一样,C末端为K,那么在相同盐酸水解条件下它们E/D和E/K的比值应该相等.相反,如果突变体的C末端为Q,那么Q酸水解转变成E,则突变体分子中E/D的比值应该为HWTX—I的2倍,E/K比值也相应升高。实验所得的结果为后者,证明该突变体C末端为Q,而不是K.

2.3 生物学活性分析结果

小鼠脑室注射天然突变体后,发生惊厥,约l min后死亡.对照组注射生理盐水后,小鼠活动正常,未出现任何异常反应.浓度为20 t~g/mL时,天然突变体对小鼠膈神经膈肌标本的神经肌肉接头传递无明显影响,而用l0 g/mL的HWFX—I能在约16 rain内完全阻断小鼠膈神经膈肌接头传递.

 

3 讨论

研究蜘蛛毒素中蛋白质类活性成分的结构与功能时,首先要做的工作之一就是测定其氨基酸序列.Ed.mall降解是公认的测定氨基酸序列的经典方法,具有准确性高和自动化程度好等优点,但Edman降解法也有许多局限性,如1)分析速度慢,消耗样品量多;2)随着降解次数的增多,体系的污染程度增加,所以一般只在降解30步以内有效;3)N.端封闭的多肽、肽链中存在修饰氨基酸或稀有氨基酸时,不能测定或不能准确测定等 .如本研究中,测定突变体的序列时就出现C.端序列信号不明的情况.串联生物质谱技术的发展,给微量蛋白质的序列分析提供了新的方法.该方法具有样品消耗少和快速、省时等特点,从而成为Edman降解法的极好补充.当然,一般的串联质谱测序法也有准确性不高、不能区分相对分子质量相同的I和L和一般难以准确区分相对分子质量相近的K和Q等局限性.就氮基酸组成分析而言,尽管随着现代生物技术的发展,该方法已逐渐为其他更准确、快速的分析方法所替代,但仍在某些特定的实验条件下(如本研究中突变体分子中C一端K或Q的鉴定)有着特殊的用途.关键在于如何综合利用各种实验方法达到研究的目的.之所以将本研究的目标肽称为HW IN—I的突变体,是因为它由32个残基组成.前31个残基与HWTX—I的完全相同,第32位残基相当于由H~'TX—I的32位赖氨酸残基(K)突变成谷氨酰胺(Q),缺少HWTX—I的33位亮氨酸.值得注意的是,突变体与HWIX—I的序列具有高度的同源性,但在功能上却有明显的差异,如不能阻断小鼠膈神经膈肌接头传递.膜片钳实验结果也表明,该天然突变体对Ca2电流的抑制作用也明显低于H 1 —I,推测这种活性的差别可能是由于Hw Ⅸ一I C末端第33位1 缺失和32位K突变Q,改变了分子构像表面关键部位的带电性,进而使与受体的结合性能发生变化.本实验结果证明,K32残基对于HWTX—I的生物学活性有关键性的意义.有关研究正在进一步的进行中.