钢之炼金术师剧情详解:珠蚌软体中小分子活性物质的研究dd

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双壳贝类软体部位活性物质研究概况

首席医学网      2010年01月15日 14:58:45 Friday  

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作者:姚静倩,吴皓,陈蕾    作者单位:南京中医药大学新药及海洋药物研究开发中心,江苏 南京 210029)

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【关键词】  双壳贝类;软体动物;活性物质;生物活性;综述

        贝类隶属于软体动物门中的瓣鳃纲,现存种类有1万多种,主要生活在海洋和淡水湖沼中,由于其特殊的生活环境和生理构造,常被称为“水环境检测器”[1]。贝类一般由软体部位和外壳组成,根据外壳的特点还可分为5类,而现阶段研究较广的为双壳贝类。据《内经》、《本草纲目》等古文献记载,贝类的软体部分不仅是食用佳品,而且具有很高的药用价值。近年来,随着人们对化学药物不良反应认识的提高,开发低毒高效的新药已成为热点。通过对贝类的深入研究,发现贝壳主要含有碳酸钙,其软体部位含有大量生物活性物质,且资源丰富,已经受到国内外的广泛关注,是新药和功能性食品开发的重要切入点。笔者现将对国内外一些较常见的双壳贝类软体部位的研究进展作一综述。

  双壳贝类软体的主要活性物质

  资料表明,各国学者应用现代研究方法已经从双壳贝类软体部位中分离和鉴定出了许多结构新颖、作用独特的天然物质,其中主要有多糖及其复合物、活性肽、牛磺酸等,具有很高的药学价值。

  1.1  多糖及其复合物

  自20世纪70年代以来研究发现,多糖及其复合物在生物体中不仅是作为能量资源和构成材料,更重要的是,它存在于一切细胞膜结构中,参与生命现象中细胞的各种活动,具有多种多样的生物学功能。目前,国内外学者已经从多种贝类软体中提取出具有与植物多糖相似生理活性的多糖类化合物,该类多糖的研究是新药开发的重要方向之一。
   
  尹氏等[2]采用超声波提取法,从文蛤(Meretrix meretrix)软体中提取出含有生物活性的多糖类物质,并确定最佳工艺为超声提取30 min,提取2次,料水比例为1∶20。王氏等[3]采用热碱提取法,从我国东海近江牡蛎肉中得到牡蛎多糖(Oysterpolysaccharides,Ops),研究表明,该多糖能增强小鼠细胞免疫、体液免疫功能,并有一定的抗肿瘤和抗氧化作用。沈氏等[4]在4 ℃时,用浓度为5%的NaOH溶液提取河蚌多糖,其纯度含量最佳,药理研究显示,该多糖具有对心血管系统的作用、抑制肿瘤细胞生长的活性、增强巨噬细胞(Mφ)的吞噬作用等。周氏等[5]用乙醇沉淀法,从河蚌贝类中也得到一种多糖。

  经过结构解析,表明此多糖的基本单元主要由葡萄糖、氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸等4种成分组成。此外,还有多种多糖复合物从贝类软体中提取分离出来,如糖蛋白、糖肽等,具有与多糖相似的药理作用。

  1.2  活性肽

  活性肽是指具有特殊生理功能的肽类物质,其结构可以从简单的二肽到较大分子的多肽。活性肽现阶段主要研究方向为抗肿瘤,并已取得很大进展。早在1964年,Schmeer[6]在文蛤软体中提取得到一种肿瘤抑制因子,对小鼠S180肉瘤有显著的抑制作用,经过对其成分的下一步探讨,指出其是一类分子量小于10000的多肽类物质。Bernay等[7]从牡蛎匀浆液中分离得到一种具有抗肿瘤作用的低分子牡蛎活性肽1(bioactive peptides of oyster 1,BPO-1),实验表明,该物质可以明显抑制胃腺癌和肺腺癌的细胞生长。李氏等[8]从扇贝中提取出一种多肽(polypeptides from chlamys farreri,PCF),发现其能促进人脐血干细胞分化的功能。此外,如牡蛎、贻贝等双壳贝类血浆中含有一类小分子阳离子且富含半胱氨酸的活性肽,研究发现,该活性肽具有抗菌的活性,是贝类免疫体系的重要组成部分[9]。根据它们的结构特征分为4类:防卫肽(Defensins)、Myticins、Mytimycin、Mytilins。其中,防卫肽和Myticins主要抑制革兰氏阳性菌或真菌,对阴性菌活性较弱,Mytimycin仅有抗真菌活性,而Mytilins则能广谱抗菌[10]。

  1.3  牛磺酸

  牛磺酸(Taurine)是一种含硫的β氨基酸,也是一种重要的生物活性物质,具有促进生长发育、改善视力、调节血糖、保护心肌细胞等功效。随着对其生理作用的深入认识,市场需求逐步增长,因此有着广阔的前景。牛磺酸以游离形式广泛存在于海产品及哺乳动物的几乎所有脏器中,尤其在贝类、甲壳类动物中牛磺酸的含量最多[11]。钱氏等[12]在温度40 ℃、pH 5.5条件下,从新鲜珍珠贝母软体提取物中,通过细胞自溶破壁40 h后,得到较高含量的牛磺酸,占氨基酸总量的80.6%。李氏等[13]在温度45 ℃、pH 5.5、自溶24 h条件下,从四角蛤蜊中提取得到牛磺酸,为蛤蜊的开发利用奠定了实验基础。

  1.4  其他

  早在20世纪70年代,曾有学者在两种淡水贝类软体部位(Anodonta cygnea 和Unio pictorum)的小肠上皮组织和血淋巴提取物中,发现了免疫活性胰岛素或其类似物,药理实验证实其有调节糖代谢的功效,可以有效降低血糖浓度,为开发新药提供了依据[14]。萜类和甾醇类物质由于具有显著的生物活性,一直受到广泛重视。自20世纪80年代以来,从海洋生物中相继发现了许多结构新颖的该类化合物,其中在贝类中也有发现,如在扇贝中发现了24-失碳甾醇。另外,还有多种不饱和脂肪酸、氨基酸、微量元素、腺苷被发现。贝类软体部位的物质成分研究还有待于进一步发展,尤其应当加强对淡水贝类的研究。

  活性物质的生物活性研究

  2.1  抗肿瘤作用

  目前,广泛应用于抗肿瘤的药物绝大多数为化学合成物,具有很强的细胞毒性和不良反应,且恶性肿瘤细胞长期接触这些药物后,容易产生耐药性,因此,开发新药成为研究热点。经过大量药理实验,发现双壳贝类软体提取物中含有多种具有抗肿瘤活性的物质,其中研究较多的主要是多糖类化合物、活性肽、甾类等。

  童氏等[15]从褶纹冠蚌的水提液中分离出相对分子质量≤30 kD的多糖和相对分子质量≥30 kD的糖蛋白,研究表明,糖蛋白部分对小鼠L1210淋巴白血病瘤细胞、S180肉瘤、艾氏腹水瘤(EAC)显示出一定的抗肿瘤活性,且对荷瘤小鼠NK细胞杀伤活性有明显增强作用,其作用机理类似于肿瘤抑制因子;而小分子多糖部分则无明显的抗肿瘤作用,但对荷瘤小鼠NK细胞杀伤活性有一定增强作用,可能有增强免疫的作用。姚氏等[16]通过现代技术,从一种海洋双壳贝类泥蚶中提取制得一组多肽组分(相对分子质量≤6000),并进行了该物质对体外培养的两种人肿瘤细胞的抑制生长实验和对小鼠S180、H22实体瘤和艾氏腹水瘤(EAC)的治疗实验,结果表明,泥蚶多肽在0.25~1.0 g/L内,对A549和Ketr-3细胞的增殖及细胞蛋白质合成具有明显的抑制作用,对A549和Ketr-3的周期阻滞分别为G2-M期和G0-G1期。泥蚶多肽在100~400 mg/kg内,对小鼠S180和H22的抑瘤率分别达到29.35%~55.43%和26.87%~44.12%,明显延长EAC小鼠的生存时间,因其相对分子质量低而致敏作用小,无明显的不良反应,故值得深入研究。Wu Ting-He等[17]从文蛤中提取出一类甾类化合物(5α,8α-epidioxycholest-6- ene-3β-ol,MME),发现该物质能抑制肝癌细胞的生长,并能诱导处于细胞周期G1时期的肝癌细胞分化为两类细胞系HepG2和Hep3B,其中HepG2比Hep3B对MME更敏感。贝类中可能还含有其他抗肿瘤活性物质,还有待于进一步验证。

  2.2  免疫调节作用

  由于现阶段人们生活饮食不规律造成免疫力降低,引发了一系列疾病,因此,开发增强免疫力的药物和保健品具有重要意义。多项研究结果表明,双壳贝类软体含有多种免疫调节活性物质,在增强免疫方面效果显著。

  金氏等[18]通过对珠贝提取物药理实验的研究,发现该提取物能明显增强小鼠的单核巨噬细胞吞噬能力,对二硝基氯苯造成的小鼠迟发性超敏反应有抑制作用,对造血功能受损的小鼠有恢复作用,并对环磷酰胺抑制的T淋巴细胞转化有促进作用,提示该提取物具有良好的免疫调节作用。袁氏等[19]采用多种方法观察河蚌提取物对小鼠免疫功能的影响,如淋巴细胞增殖反应、白细胞介素-2活性检测、迟发性过敏反应等,结果表明,KAL对小鼠的细胞免疫和体液免疫及非特异性免疫反应有增强作用。杜氏等[20]利用RP-HPLC,从栉孔扇贝中分离得到4个分子量800~1000 Da的小分子多肽,采用地塞米松与细胞共同培养的方法,观察到该多肽不仅能显著减轻其对免疫细胞的抑制作用,同时还可以促进免疫细胞活性。刘氏等[21]发现,扇贝多肽在正常条件下可显著增强免疫细胞的活性,并且可拮抗雌激素对免疫细胞的抑制作用。

  2.3  抗炎、抗病毒作用

  现阶段,大部分解热镇痛抗炎药物的作用机制为抑制体内环氧酶(COX)的生物合成,但由于选择性差,易引起心血管方面的不良反应,所以,开发高选择性的COX抑制药有着重要意义。S Mcphee等[22]研究发现,一种新西兰绿唇贝的提取物具有抗炎活性,该提取物能在体外抑制COX-2,且在被KOH皂化后活性显著增强,这为开发选择性抑制COX-2药物提供了基础。袁氏等[23]发现,厚壳贻贝脂溶性提取物具有很强的抗炎作用,能显著抑制大鼠棉球肉芽肿和大鼠佐剂性关节炎原发性和继发性症状,且无明显不良反应,为新型抗炎药物的开发提供了理论基础。

  近年来,研究人员还发现部分贝类多糖具有抗病毒的活性。国外学者通过实验表明,贻贝多糖具有良好的抗流感病毒活性,可以使致死剂量感染的小鼠死亡率降低50%~60%,并对流感病毒引起的小鼠肺炎病理改变有明显抑制作用[6]。另有研究发现,从文蛤中分离出一种多糖,其能通过抑制病毒-细胞融合来发挥抗HIV活性[24],有望开发出相应的药物。

  2.4  调节血糖作用

  滕氏等[25]发现,牡蛎提取物能刺激胰岛素分泌,减轻胰腺负担,对降低血糖、尿糖,改善临床症状效果显著。于氏等[26]用牡蛎提取物研究其对四氧嘧啶所致小鼠胰岛损伤的保护作用,结果表明,该提取物能保护胰岛β细胞对抗有害物质的损伤,并可使胰岛素分泌保持一定水平,能有效地防止血糖的升高和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的过量分泌,从而降低TNF-α的毒性作用。有文献指出,贝类中含有的牛磺酸与其降血糖作用有密切联系。研究发现,牛磺酸有胰岛素样效应,对胰岛β细胞有保护作用[27],推测其有效成分可能为牛磺酸。也有研究发现贝类中含有的多糖有降血糖的作用,可能与其能够补充糖原有关,有待进一步考证。

  2.5  其他

  据报道,河蚌具有镇痛、降血压的功效,由于其含有丰富的蛋白质和微量元素,也是新型饲料的开发源。刘氏等[28]发现,贝类(牡蛎、贻贝、扇贝)提取物能降低血浆及血管壁中血栓素A2水平,具有调节其与前列环素平衡、抑制血栓形成的作用,有利于防止动脉粥样硬化的形成和发展。文蛤水提液有扩张小动脉作用,对以小动脉痉挛为病理性基础的疾病具有预防和治疗价值,其有效成分被认为可能是腺苷相关物质[29]。另外, Y Kimura等[30]观察河蚌水提物对脂肪肝和肝损伤小鼠模型的药理作用,结果发现,该提取物能显著降低血清中的自由脂肪酸、三酰甘油、过氧化脂质及胆固醇,经分离得到一种活性物质。鉴定后确认为腺苷,可以作为脂肪肝的预防和辅助治疗物质。

  结语及展望

  贝类由于资源丰富,且其软体部位富含多种生物活性物质而备受国内外医药界的重视,目前研究已取得了丰硕的成果。我国也在该领域取得了一定的成绩,如开发了海王金樽、文蛤精、金牡蛎胶囊等产品。但也还存在一些需要解决的问题。①当前对贝类的研究大多集中于海洋贝类。我国淡水资源丰富,有大量淡水珠贝用于生产珍珠,其软体部分未得到充分利用,应加强该方面的研究。②对贝类提取物成分的研究范围较窄。国内大多集中于大分子化合物的研究,药理作用也以抗肿瘤、增强免疫等活性为热点,其他成分及活性研究还不够全面。③在研究贝类提取物的同时,应当加强对其废弃物下脚料的综合利用。贝类软体经提取后的残渣富含蛋白质,贝壳含有丰富的矿物元素,是良好的饲料添加剂,值得开发利用。④对贝类提取物中有效成分的分离及其作用机制还需要进一步的探讨。

  总之,贝类具有广阔的开发前景,是新药、保健品、功能性食品的新来源,具有良好的市场潜力。

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《南京中医药大学》 2009年

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珠蚌软体中小分子活性物质的研究

姚静倩  

【摘要】: 本论文来源于江苏省高新技术产业化课题《江苏地产蚌类资源深加工产品的研究开发》,编号:JHB05-26。珠蚌具有丰富的营养成分和良好的药用价值。本实验室前期实验主要对珠蚌软体多糖及其活性进行了深入研究。本课题旨在研究珠蚌除多糖及蛋白质等大分予以外的小分子活性物质。从珠蚌水提醇沉上清液的成分分离鉴定及其活性筛选入手,对珠蚌水提醇沉上清液浸膏及其石油醚、正丁醇萃取物进行了成分与活性研究。 本论文的主要研究内容包括以下几个部分: 1.文献研究 查阅有关珠蚌的研究文献,了解珠蚌的历史沿革和现代研究进展。查阅有关淡水及海洋贝类的文献,了解贝类主要可能含有的物质及其生物活性,为实验设计和实验内容奠定文献资料基础。 2.珠蚌水提醇沉上清液部分的成分定性鉴别 根据前期成熟完善的工艺路线和操作步骤,从珠蚌软体中提取多糖后的水提醇沉上清液浸膏入手,对水提醇沉上清液进行成分的预试验研究。结果发现:石油醚萃取部分含有油脂和甾类物质,正丁醇萃取部分主要含有甾类物质、糖苷类、生物碱类、有机酸类物质,水残留液中主要有氨基酸、糖类物质等。 3.珠蚌水提醇沉上清液浸膏的活性筛选 根据古籍记载,珠蚌水煎液具有“解热毒,托斑疹,解痘毒”的功效,故活性研究首先从抗炎实验入手。通过二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验和棉球肉芽肿实验来观察珠蚌水提醇沉上清液的抗炎作用。结果证明珠蚌水提醇沉上清液对小鼠耳廓肿胀、小鼠棉球肉芽肿的形成均有明显的抑制作用。说明珠蚌水提醇沉上清液中含有具有抗炎活性的小分子物质。将水提醇沉上清液通过分别用石油醚和正丁醇萃取,分成石油醚层、正丁醇层和萃取后水层,继续进行有效部位筛选。珠蚌水提醇沉上清液中石油醚、正丁醇萃取部位对小鼠耳廓肿胀、小鼠棉球肉芽肿的形成均有明显的抑制作用,说明这两个部位含有抗炎活性物质。 4.珠蚌石油醚萃取部位成分的研究 通过前期实验,发现石油醚萃取部位有明显的抗炎活性,故对该部位成分进行进一步研究。将该部位浸膏采用硅胶柱层析分离,以石油醚-乙酸乙酯不同配比梯度洗脱,分离得到脂肪酸部分和甾醇部分。通过GC-MS技术对珠蚌脂肪酸的组成进行了分析,共鉴定出14种脂肪酸,其中饱和脂肪酸8种,主要为十六烷酸(软脂酸)、十七烷酸、十八烷酸(硬脂酸)等,占脂肪酸总量的29.24%。含不饱和脂肪酸6种,主要有9-十六碳烯酸、9-十八碳烯酸(油酸)、9,12-十八碳二烯酸(亚油酸)、5,8,11,14-二十碳四烯酸(花生四烯酸)等,占总量的42.59%,明显高于饱和脂肪酸。从石油醚萃取部位得到珠蚌甾醇,继续分离获得的样品,经碳氢等色谱、光谱分析表明该甾醇为混合物。 4.珠蚌石油醚萃取部位的脂肪酸类和甾醇类物质抗炎活性研究 通过二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验和珠蚌甾醇对小鼠腹腔巨噬细胞炎症因子释放影响实验,发现珠蚌甾醇类物质对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀有明显的抑制作用,而脂肪酸则无明显作用。珠蚌甾醇在浓度为50ug/mL、25ug/mL和12.5ug/mL均能显著抑制脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞释放No、TNF-α及IL-1等细胞炎性因子。 5.珠蚌中核苷类物质的研究 前期实验从正丁醇浸膏中检测到尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷及胸腺嘧啶,论文从珠蚌中检测到核苷类物质并对五种主要成分进行了含量测定。以珠蚌中各核苷含量的比例进行配伍,通过二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验、小鼠棉球肉芽肿实验来观察核苷的抗炎作用。结果表明珠蚌中所含的核苷对二甲苯所致的小鼠耳廓肿胀与小鼠棉球肉芽肿的形成都具有明显的抑制作用。说明核苷类成分为珠蚌水提醇沉上清液正丁醇部位浸膏的抗炎活性成分之一。 研究结果表明珠蚌软体水煎液除去大分子物质后的上清液中具有抗炎活性的主要物质为甾醇类和核苷类。

【关键词】:小分子物质 抗炎活性 甾醇 脂肪酸 核苷
【学位授予单位】:南京中医药大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R284.1
DOI】:CNKI:CDMD:2.2009.252003
【目录】:

·                            中文摘要6-8

·                            英文摘要8-11

·                            引言11-12

·                            第一部分 文献研究12-25

·                            第一章 双壳贝类活性物质研究进展12-20

·                            参考文献17-20

·                            第二章 珠蚌的研究进展20-25

·                            参考文献23-25

·                            第二部分 实验部分25-74

·                            第三章 珠蚌水提醇沉上清液的成分研究25-28

·                            1 珠蚌多糖与水提醇沉上清液浸膏的制备25-27

·                            2 成分预试验27-28

·                            第四章 珠蚌水提醇沉上清液浸膏的活性筛选28-36

·                            1 珠蚌水提醇沉上清液浸膏的抗炎作用研究28-31

·                            2 珠蚌水提醇沉上清液浸膏抗炎活性部位的筛选31-35

·                            参考文献35-36

·                            第五章 珠蚌石油醚萃取物的成分研究36-44

·                            1 珠蚌石油醚萃取物的提取分离与成分鉴定36-39

·                            2 珠蚌脂肪酸的成分分析39-43

·                            参考文献43-44

·                            第六章 珠蚌石油醚萃取物的抗炎活性研究44-55

·                            1 珠蚌石油醚萃取物的抗炎实验44-46

·                            2 珠蚌甾醇对体外培养的小鼠腹腔巨噬细胞中炎症因子释放的影响46-53

·                            参考文献53-55

·                            第七章 珠蚌中核苷类物质的鉴定与含量测定55-69

·                            1 成分定性检测55-59

·                            2 三角帆蚌中核苷类物质的含量测定59-67

·                            参考文献67-69

·                            第八章 珠蚌中核苷类物质的抗炎作用研究69-74

·                            1 二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验69-71

·                            2 小鼠棉球肉芽肿试验71-73

·                            参考文献73-74

·                            结论74-76