儀器分析——毛細管電泳法

　　毛細管電泳法是指以彈性石英毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅動力，依據樣品中各組分的淌度（單位電場強度下的遷移速度）和/或分配行為的差異而實現分離的一種分析方法。

　　當熔融石英毛細管內充滿操作緩衝液時，管內壁上硅羥基解離釋放氫離子至溶液中使管壁帶負電荷並與溶液形成雙電層（ζ電位），即使在較低pH值的緩衝液中情況也如此。當毛細管兩端加上直流電壓時將使帶正電的溶液整體地移向負極端。此種在電場作用下溶液的整體移動稱為電滲流（EOF）。內壁硅羥基的解離度與操作緩衝液pH值和添加的改性劑有關。降低溶液pH值會降低解離度，減小電滲流；增高溶液pH值提高電離度，增加電滲流。有機添加劑的加入有時會抑制內壁硅羥基的解離，減小電滲流。在操作緩衝液中帶電粒子在電場作用下以不同速度朝著帶相反電荷的電極移動，形成電泳。在操作緩衝液中帶電粒子運動速度等於其電泳速度和電滲速度的矢量和。電滲速度通常大於電泳速度，因此電泳時各組分即便是陰離子也會從毛細管陽極端流向陰極端。為了減小或消除電滲流，除了降低操作緩衝液pH值之外，還可以採用內壁聚合物塗層的毛細管。這種塗層毛細管可減低大分子在管壁上的吸附。

　　1．分離模式

　　毛細管電泳的分離模式有以下幾種。

　　（1）毛細管區帶電泳（CZE）將待分析溶液引入毛細管進樣一端，施加直流電壓後，各組分按各自的電泳流和電滲流的矢量和流向毛細管出口端，按陽離子、中性粒子和陰離子及其電荷大小的順序通過檢測器。中性組分彼此不能分離。出峰時間稱為遷移時間（tm），相當於高效液相色譜和氣相色譜中的保留時間。

　　（2）毛細管凝膠電泳（CGE）在毛細管中裝入單體和引發劑引發聚合反應生成凝膠，這種方法主要用於分析蛋白質、DNA等生物大分子。另外還可以利用聚合物溶液，如葡聚糖等的篩分作用進行分析，稱為毛細管無膠篩分。有時將它們統稱為毛細管篩分電泳，下分為凝膠電泳和無膠篩分兩類。

　　（3）毛細管等速電泳（CITP）採用前導電解質和尾隨電解質，在毛細管中充入前導電解質後，進樣，電極槽中換用尾隨電解質進行電泳分析，帶不同電荷的組分遷移至各個狹窄的區帶，然後依次通過檢測器。

　　（4）毛細管等電聚焦電泳（CIEF）將毛細管內壁塗覆聚合物減小電滲流，再將樣品和兩性電解質混合進樣，兩個電極槽中分別加入酸液和鹼液，施加電壓後毛細管中的操作電解質溶液逐漸形成pH梯度，各溶質在毛細管中遷移至各自等電點（pI）時變為中性形成聚焦的區帶，而後用壓力或改變檢測器末端電極槽儲液的pH值的辦法使溶質通過檢測器。

　　（5）膠束電動毛細管色譜（MEKC或MECC）當操作緩衝液中加入大於其臨界膠束濃度的離子型表面活性劑時表面活性劑就聚集形成膠束，其親水端朝外憎水非極性核朝內，溶質則在水和膠束兩相間分配，各溶質因分配係數存在差別而被分離。對於常用的陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉，進樣後極強親水性組分不能進入膠束，隨操作緩衝液流過檢測器（容量因子k′=0）；極強憎水性組分則進入膠束的核中不再回到水相，最後到達檢測器（k′＝∞）。其他常用的膠束試劑還有陽離子表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨，膽酸等。

　　（6）毛細管電色譜（CEC）將細粒徑固定相填充到毛細管中或在毛細管內壁塗覆固定相以電滲流驅動操作緩衝液（有時再加輔助壓力）進行分離。［醫學 教育網蒐集整理］

　　以上分離模式（1）和（5）使用較多。（5）和（6）兩種模式的分離機理以色譜為主，但對荷電溶質則兼有電泳作用。

　　操作緩衝液中加入各種添加劑可獲得多種分離效果。如加入環糊精、衍生化環糊精、冠醚、血清蛋白、多糖、膽酸鹽或某些抗生素等，可拆分手性化合物；加入有機溶劑可改善某些組分的分離效果，以至可在非水溶液中進行分析。

　　2．對儀器的一般要求

　　毛細管電泳儀的主要部件和其性能要求如下。

　　（1）毛細管用彈性石英毛細管，內徑50μm和75μm兩種使用較多（毛細管電色譜有時用內徑再大些的毛細管）。細內徑分離效果好，且焦耳熱小，允許施加較高電壓，但若採用柱上檢測因光程較短檢測限比較粗內徑管要差。毛細管長度稱為總長度，根據分離度的要求，可選用20～100cm長度，進樣端至檢測器間的長度稱為有效長度。毛細管常盤放在管架上控制在一定溫度下操作，以控制焦耳熱，操作緩衝液的黏度和電導度，對測定的重複性很重要。

　　（2）直流高壓電源採用0～30kV（或相近）可調節直流電源，可供應約300μA電流，具有穩壓和穩流兩種方式可供選擇。

　　（3）電極和電極槽兩個電極槽裡放入操作緩衝液，分別插入毛細管的進口端與出口端以及鉑電極，鉑電極接至直流高壓電源，正負極可切換。多種型號的儀器將樣品瓶同時用做電極槽。

　　（4）沖洗進樣系統每次進樣之前毛細管要用不同溶液沖洗，選用自動沖洗進樣儀器較為方便。進樣方法有壓力（加壓）進樣、負壓（減壓）進樣、虹吸進樣和電動（電遷移）進樣等。進樣時通過控制壓力或電壓及時間來控制進樣量。

　　（5）檢測系統紫外-可見光分光檢測、激光誘導螢光檢測、電化學檢測和質譜檢測均可用作毛細管電泳的檢測器。其中以紫外-可見光分光光度檢測器應用最廣，包括單波長、程序波長和二極管陣列檢測器。將毛細管接近出口端的外層聚合物剝去約2mm一段，使石英管壁裸露，毛細管兩側各放置一個石英聚光球，使光源聚焦在毛細管上，透過毛細管到達光電池。對無光吸收（或螢光）的溶質的檢測，還可採用間接測定法，即在操作緩衝液中加入對光有吸收（或螢光）的添加劑，在溶質到達檢測窗口時出現反方向的峰。

　　（6）數據處理系統與一般色譜數據處理系統基本相同。

　　3．基本操作

　　（1）按照儀器操作手冊開機，預熱，輸入各項參數，如毛細管溫度、操作電壓、檢測波長和沖洗程序等。操作緩衝液須過濾和脫氣。沖洗液、緩衝液等放置於樣品瓶中，依次放入進樣器。

　　（2）毛細管處理好壞對測定結果影響很大。未塗層新毛細管要用較濃鹼液在較高溫度（例如1mol/L氫氧化鈉液在60℃）沖洗，使毛細管內壁生成硅羥基，再依次用0.1mol/L氫氧化鈉，水，操作緩衝液沖洗各數分鐘。兩次進樣中間可僅用緩衝液沖洗，但若發現分離性能改變，則開始須用0.1mol/L氫氧化鈉沖洗，甚至要用濃氫氧化鈉液升溫沖洗。凝膠毛細管，塗層毛細管，填充毛細管的沖洗則應按照所附說明書操作。沖洗時將盛溶液樣品瓶依次置於進樣器，設定順序和時間進行。

　　（3）操作緩衝液的種類、pH值和濃度，以及添加劑（用以增加溶質的溶解度和/或控制溶質的解離度，手性拆分等）的選定對測定結果的影響也很大，應照各品種項下的規定配製，根據初試的結果調整、優化。

　　（4）將待測樣品溶液瓶置於進樣器中，設定操作參數，如進樣壓力（電動進樣電壓）、進樣時間、正極端或負極端進樣、操作電壓或電流、檢測器參數等，開始分析。根據初試的電泳譜圖調整儀器參數和操作緩衝液以獲得優化結果。而後用優化條件正式分析。

　　（5）分析完畢後用水沖洗毛細管，注意將毛細管兩端侵入水中保存，如果長久不用應將毛細管用氮吹乾，最後關機。［醫學教育網蒐集整理］

　　（6）由於進樣方法的限制目前毛細管電泳的精密度比用定量閥進樣的高效液相色譜法要差，故定量測定以採用內標法為宜。用加壓或減壓法進樣時，樣品溶液黏度會影響進樣體積，應注意保持試樣溶液和對照品溶液黏度一致；用電動法進樣時，被測組分因電歧視現象和溶液離子強度會影響待測組分的遷移量，也要注意其影響。

　　4．系統適用性試驗

　　欲考察所配置的毛細管分析系統和設定的參數是否適用，測試項目和方法與高效液相色譜法或氣相色譜法相同，相關的計算式和要求也相同。如重複性（相對標準偏差，RSD）、容量因子（k′）、毛細管理論板數（n）、分離度（R）、拖尾因子（T）、線性範圍、最低檢測限（LOD）和最低定量限（LOQ）等，可參照測定。具體指標應符合各品種項下的規定。特別是進樣精度，不同荷電溶質遷移速度的差異對分析精密度的影響。毛細管電泳法是指以彈性石英毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅動力，依據樣品中各組分的淌度（單位電場強度下的遷移速度）和/或分配行為的差異而實現分離的一種分析方法。

　　當熔融石英毛細管內充滿操作緩衝液時，管內壁上硅羥基解離釋放氫離子至溶液中使管壁帶負電荷並與溶液形成雙電層（ζ電位），即使在較低pH值的緩衝液中情況也如此。當毛細管兩端加上直流電壓時將使帶正電的溶液整體地移向負極端。此種在電場作用下溶液的整體移動稱為電滲流（EOF）。內壁硅羥基的解離度與操作緩衝液pH值和添加的改性劑有關。降低溶液pH值會降低解離度，減小電滲流；增高溶液pH值提高電離度，增加電滲流。有機添加劑的加入有時會抑制內壁硅羥基的解離，減小電滲流。在操作緩衝液中帶電粒子在電場作用下以不同速度朝著帶相反電荷的電極移動，形成電泳。在操作緩衝液中帶電粒子運動速度等於其電泳速度和電滲速度的矢量和。電滲速度通常大於電泳速度，因此電泳時各組分即便是陰離子也會從毛細管陽極端流向陰極端。為了減小或消除電滲流，除了降低操作緩衝液pH值之外，還可以採用內壁聚合物塗層的毛細管。這種塗層毛細管可減低大分子在管壁上的吸附。